陈诗怡，赵钰萍，赵婷，李菁，施红媛，李颖，杨净思

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南 昆明 650031

乙型病毒性肝炎（viral hepatitis B，HB），又称乙肝，是全球重大公共卫生安全问题之一，乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）属嗜肝DNA 病毒科［1］，其感染后可表现为急性肝炎、慢性肝炎和无症状感染，部分患者会发展为肝功能衰竭、肝硬化或肝癌。HBV 在全世界约2.5 亿人中造成慢性感染，每年约100 万人死亡［2］。目前，干扰素等免疫调节剂和核苷类似物（nucleoside analogue，NA）作为2 个获批准的治疗药物，可抑制HBV 复制和慢性肝炎的进展。与其他药物相比，这两种药物很少导致耐药性，且副作用较小，但一般不能治愈，大部分接受乙肝治疗的患者需终身服药［3-5］，因此预防HBV 感染至关重要，接种安全有效的乙肝疫苗（hepatitis B vaccine，HepB）是主要的预防措施。我国是乙肝高流行地区之一，为了预防和控制HBV 感染，我国于1983 年进行血源性HepB 的研究，1985 年正式获得生产许可［6］，自1992 年起将HepB 纳入国家儿童免疫规划，婴幼儿需在出生后24 h 内、1 月龄和6 月龄各接种1 剂HepB［7］。接种HepB 后可产生具有保护性的乙肝表面抗体（hepatitis B surface antibody，HBsAb），定量检测HBsAb 水平可分析判断HepB 的免疫效果。常见的HBsAb 检测方法有酶联免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、胶体金法、化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）等［8］。本研究采用电化学发光免疫分析法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）和ELISA 法分别检测临床已接种HepB 的婴幼儿血清HBsAb，并对两种方法检测结果进行比较。

1 材料与方法

1.1 临床样本 样本来自2015 年在广西壮族自治区柳州市开展的一项“随机、盲法、单中心、平行对照试验评价Ⅰ型+ Ⅲ型口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（人二倍体细胞）和Ⅰ型+ Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗糖丸（人二倍体细胞）与IPV 联合序贯免疫接种在2 月龄婴儿中的免疫原性和安全性临床研究”研究项目，临床试验编号：NCT03614702，获得广西伦理委员会批准（GXIRB2015-0024）。选取足月出生、出生时体重达标、腋下体温正常、已按国家免疫规划要求按时接种HepB 的955 份血清样本。

1.2 主要试剂及仪器 乙型肝炎病毒抗体（Anti-HBSH）测定试剂盒（电化学发光法）（批号：47336-501）、高低水平质控品PreciControl A-HBS1、Preci-Control A-HBS2（批号：43664801）、Cobase411 全自动电化学发光免疫分析仪购自瑞士罗氏诊断公司；乙型肝炎病毒表面抗体测定试剂盒（酶联免疫法）（批号：RQ20200502A）购自北京万泰生物药业股份有限公司；超微量核酸蛋白分析仪购自美国THERMO FISHER SCIENTIFIC。

1.3 检测方法

1.3.1 ECLIA 法 按照全自动操作流程检测血清样本，由软件自动显示测试结果。仪器检测范围为2 ～1 000 mIU ／ mL，大于仪器检测上限的需稀释后重新检测。阳性判定标准为：HBsAb 水平≥10 mIU／mL。

1.3.2 ELISA 法 具体操作按试剂盒说明书进行。在96 孔板相应孔中加入50 μL 血清样品或标准品后，加入50 μL 酶标试剂，孵育60 min；洗板显色，根据定标曲线计算待测样本抗体浓度。阳性判定标准为：HBsAb 水平≥10 mIU ／ mL。

1.4 方法的验证

1.4.1 精密度验证 参考美国CLIA′88 标准［9］，采用两个水平质控品进行验证，每个质控品连续5 d每天检测3 次，得到15 个检测数据，计算均值和标准差（SD），与靶值相比较，在靶值± 3 SD 内则符合验证要求。ECLIA 法使用80.4 mIU ／ mL 的高值质控和6.66 mIU ／ mL 的低值质控进行验证，ELISA 法使用100 mIU ／ mL 的高值质控和30 mIU ／ mL 的低值质控进行验证。

1.4.2 正确度验证 参考美国CLIA′88 标准［9］及《临床检验质量控制技术》［10］，采用试剂厂家提供的标准物质进行验证，每个标准物质检测5 d，每天检测2 次，计算均值和SD，将实测值与靶值相比较计算偏倚，偏倚＜4.3%符合验证要求。ECLIA 法使用浓度为461 mIU ／ mL 的标准物质进行验证，ELISA 法使用浓度为80 mIU ／ mL 的标准物质进行验证。

1.4.3 可报告范围（线性评价）验证 参考美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）EP6-A 文件［11］，选取已知浓度高水平（H）和低水平（L）血清样本（浓度尽量覆盖试剂说明书的线性范围），按比例进行配置：L、0.75 L+0.25 H、0.5 L+0.5 H、0.25 L+0.75 H、H，每份样本各检测2 次，求其变异系数（CV）、实测浓度平均值、理论浓度，以理论浓度为横坐标，实测浓度平均值为纵坐标，进行线性回归分析，得出最佳拟合方程，b 值在0.97 ～1.3 内，且R2＞0.95 则符合验证要求。

1.5 统计学分析 所有数据均使用Excel 2019 进行整理，使用SPSS 21.0 软件和MedCalc 软件进行统计学分析。两种方法定性检测结果采用一致性检验进行比较，Kappa ＞0.7 时即认为两种方法的定性检测结果具有较强的一致性。两种方法的定量检测结果采用Wilcoxon 秩和检验进行比较，以P ＜0.05为差异有统计学意义，同时绘制Bland-Altman 图比较，±1.96 SD 即为95%LoA 上下限，在此范围内，表明具有较好的一致性。

2 结 果

2.1 两种检测方法的精密度 ECLIA 法的验证结果显示，其高值质控SD 为4.02 mIU ／ mL，低值质控SD 为0.40 mIU ／ mL，所测结果高值质控均值为80.01 mIU ／ mL，低值质控均值为6.98 mIU ／ mL，均在± 3 SD 以内，证明精密度验证符合要求。见表1。ELISA 法的验证结果显示，其高值质控SD 为3.04 mIU ／ mL，低值质控SD 为2.61 mIU ／ mL，所测结果高值质控均值为103.54 mIU ／ mL，低值质控均值为36.26 mIU ／ mL，均在± 3 SD 以内，证明精密度验证符合要求。见表2。

表1 ECLIA 法的精密度验证结果（mIU ／ mL）Tab.1 Verification for precision of ECLIA（mIU ／ mL）

表2 ELISA 法的精密度验证结果（mIU ／ mL）Tab.2 Verification for precision of ELISA（mIU ／ mL）

2.2 两种检测方法正确度 ECLIA 法的验证结果显示，测定结果与标准品定值浓度的偏倚为1.33%，小于行业标准指标，符合要求。ELISA 法的验证结果显示，测定结果与标准品定值浓度的偏倚为2.84%，小于行业标准指标，符合要求。见表3。

表3 两种方法的正确度验证结果（mIU ／ mL）Tab.3 Verification for correctness of two methods（mIU ／ mL）

2.3 两种检测方法可报告范围（线性评价） ECLIA法的可报告范围（线性评价）验证结果显示，仪器可检测范围为2 ～1 000 mIU ／ mL，验证实验检测范围为3.45 ～989.05 mIU ／ mL，基本覆盖检测范围。检测结果线性方程为y = 0.995 5 x + 13.676，R2=0.998 4，b 值和R2均在要求范围内。表明ECLIA法检测HBsAb 可报告范围（线性评价）符合要求。ELISA法的可报告范围（线性评价）验证结果显示，ELISA板可检测范围为10 ～160 mIU ／ mL，验证实验检测范围为9.93 ～156.09 mIU ／ mL，基本覆盖检测范围。检测结果线性方程为y = 1.014 4 x + 4.457 5，R2= 0.990 4，b 值和R2均在要求范围内。表明ELISA 法检测HBsAb 可报告范围（线性评价）符合要求。见表4 和图1。

图1 ECLIA（A）和ELISA 法（B）的线性评价Fig.1 Linear evaluation on ECLIA（A）and ELISA（B）

表4 两种方法可报告范围（线性评价）的验证结果Tab.4 Verification for reportable range（linear evaluation）of two methods

2.4 两种方法检测结果的比较 ECLIA 及ELISA法共检测了955 份血清样本的HBsAb 水平，两种方法定性检测结果具有较强的一致性，见表5。对定量结果使用Wilcoxon 秩和检验，结果显示，Z=16.322，P ＜0.001，两种检测方法检测结果差异有统计学意义；Bland-Altman 图显示了ECLIA 和ELISA 法测得结果的均值差和95%LoA 上下限，93.2%（890／955）的点在95% LoA 上下限内，6.8%（65 ／ 955）的点在95% LoA 上下限外，差值平均值为356.4 mIU ／ mL，两种方法定量检测结果一致性较差，见图2。选取90份ECLIA 法检测浓度为10 ～50 mIU ／ mL 的样本，ELISA 法检测显示其中56 份样本＜10 mIU／mL，即为阴性，34 份样本≥10 mIU ／ mL，对两种方法检测抗体浓度进行Wilcoxon 秩和检验，结果显示差异有统计学意义（Z = 6.911，P ＜0.001），表明ELISA法对于弱阳性样本灵敏度较差。另选取90 份ECLIA法检测浓度＞2 000 mIU ／ mL 的样本，ELISA 法检测结果的均值明显低于ECLIA 法，对两种方法检测抗体浓度进行Wilcoxon 秩和检验，结果显示差异有统计学意义（Z = 7.905，P ＜0.001），对于高浓度样本两种方法定量检测结果一致性较差。见表6。

表5 两种方法定性检测结果的一致性评价Tab.5 Consistence of determination results by two methods

表6 两种检测方法对不同浓度样本的检测结果的比较Tab.6 Determination results of samples at various concentrations by two methods

图2 两种方法定量检测HBsAb 水平Bland-Altman 图Fig.2 Bland-Altman chart for quantitative determination of HBsAb level by two methods

3 讨 论

HBsAb 是HBV 侵入人体后刺激人体免疫系统产生的一种保护性抗体，人自然感染或在注射疫苗后均可产生HBsAb。HBsAb 针对乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）的a 决定簇以及各亚类决定簇［12］，提高HepB 的接种率，有效减少HBV的传播、降低乙肝感染率。检测已接种疫苗者体内的HBsAb 水平，对于判断疫苗的免疫效果具有重要价值，另外也可用于乙肝感染急性期后的病程监测。在临床上多使用ELISA 法进行检测，其具有成本低廉、操作简便、批量检测的特点［13］，但具有一定的限制性。目前临床上使用的ELISA 试剂盒均为定性检测，无法定量检测，仅有科研用试剂盒可进行定量检测，且其对低水平抗体灵敏度较低，易造成漏诊及误诊，无法准确判断低水平抗体者是否需要进行加强免疫［14］，另外Hook 效应、样本溶血、黄疸等因素均可造成假阳性、假阴性结果出现［15］。近年CLIA 技术快速发展，CLIA 是将免疫学与化学发光反应相结合进行检测，而ECLIA 法采用三丙胺作为电子供体，具有灵敏度及特异性高、重复性好、检测范围宽、试剂稳定无污染、能同时检测多种项目的特点［16］，可定量检测HBsAb，具有较好的应用效果，且其自动化程度较高，不易受人为因素的影响，在临床上常用作复检试剂［17］。

本研究对两种检测方法进行了比较，结果显示，两种方法精密度、正确度、可报告范围（线性评价）验证结果均在可接受范围内，均可为临床HBsAb 检测提供可靠的检测数据。两种方法对于955 份临床样本的定性检测结果具有较好的一致性，但定量检测结果一致性较差，对于高浓度抗体样本，ELISA 法检测结果明显低于ECLIA 法，而对于低水平样本，ELISA法具有一定的假阴性率，分析原因可能是：①ELISA法采用全手工操作，检测过程中易受到人为因素影响，加样、洗板、孵育温度和时间均可对实验结果造成影响，而ECLIA 法自动化程度较高，可有效避免人为因素引起的误差；②ELISA 法定量检测范围较窄，仅为10 ～160 mIU ／ mL，部分接种完HepB 的人体内HBsAb 水平可达上百甚至上千，因此需稀释后才能进行检测，而稀释所用的稀释液以及手工稀释产生的误差均可对实验结果造成影响；另外该方法检测范围的下限正好为HBsAb 判断阴阳性的界限，对于低水平样本的检测灵敏度不足，易将稍高于10 mIU ／ mL 的弱阳性样本错判为阴性，造成假阴性率增高。而ECLIA 法可检测范围较广，为2 ～1 000 mIU ／ mL，同时该技术使用了“链霉亲和素-生物素”放大系统与三联吡啶钌相结合，可在电场中持续获得电子发光，使其获得的信号强度较高，持续时间较长［18］，进一步提高了灵敏度和特异性，可有效地进行定量、半定量检测分析［19］。HBsAb 抗体检测方法的对比研究结果显示，ELISA 与ECLIA 法对HBsAb 的定性检测结果具有一定相似性，但ECLIA法具有较高的敏感性和准确性［20-22］，这与本研究结果一致。有研究显示，对于其他肝炎的抗原或者抗体检测，ELISA 法同样也具有一定的局限性，其对于弱阳性样本检测结果重复性较差，易造成假阴性结果出现［23-25］，这与本研究结果是一致的。

综上所述，两种检测方法均可用于HBsAb 定性检测，二者一致性较强，考虑到检测成本可选择ELISA法进行检测；对于定量检测，ECLIA 法灵敏度更高、假阴性率更低、检测结果更为可靠，因此可选择ECLIA法进行检测，具体的实际检测需综合检验需求及其他各方面因素选择相应的方法。