张志文 李也鹏

【关键词】 N6-甲基腺嘌呤;表观遗传修饰;非小细胞肺癌

中图分类号：R734.2   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.04.012

全球肿瘤流行病学调查中，占据全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤是肺癌，现如今在我国男性恶性肿瘤发病率最高的是肺癌，在女性中肺癌已经是除乳腺癌外发病率最高的肿瘤[1]，且在多中心研究中发现肺癌确诊时分期越晚，则临床表现越多。不同TNM分期的非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）生存率差别明显，分期越晚则生存率越低[2]。既往关于表观遗传学与非小细胞肺癌的研究发现二者关系密切，表观遗传修饰往往通过DNA/RNA甲基化、组蛋白修饰及染色体三维构象的改变来干扰正常基因的表达和功能[3～4]，以影响肿瘤的发生发展及耐药。其中N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）是最常见的一类RNA修饰，并且在组织发育、干细胞自我更新和分化、肿瘤耐药等过程中发挥了重要作用[5]。因此肺癌的早期筛查能够有效地提高肺癌患者的生存率，则与m6A相关的研究具有重要意义，其不仅关系着肺癌的早期诊断，甚至可能开启微创无创诊断，也关系着新的靶向药物的研究，为肺癌用药做出贡献[6]。

1 m6A RNA甲基化

过去对于表观遗传学的研究多集中于DNA修饰及组蛋白修饰，然而2012年的一项研究发现位于腺嘌呤的甲基化修饰，为后续表观遗传修饰的研究揭开了新的篇章[7]。目前，在表观遗传修饰中RNA甲基化的探索进行得如火如荼，其中作为最多见的一种RNA转录后修饰，m6A RNA甲基化是真核生物mRNAs中最为丰富的修饰，其主要集中于mRNA的启动子区，终止密码子附近以及RRACHmotif内，并受“写入”“擦除”“读取”蛋白的调控，以此影响RNA的稳定性、mRNA的翻译、选项性剪接及聚腺苷酸化[8]。其中“写入”蛋白-甲基化转移酶主要以复合物形式发挥生物学作用以催化腺苷酸发生m6A RNA甲基化修饰;反之“擦除”蛋白-去甲基化酶对发生甲基化修饰的碱基行去甲基化;而“读取”蛋白-甲基化阅读蛋白可辨别出现甲基化的碱基，进而调控下游通路，m6A RNA甲基化的修饰过程动态可逆[6，9]。

2 m6A甲基化相关蛋白

m6A甲基化过程主要受到三种蛋白的调控：甲基转移酶（writer）、去甲基化酶（eraser）及甲基结合蛋白（又称识别蛋白，reader）。m6A writer是一类可促进m6A甲基化形成的酶，其中最早发现的m6A writer甲基转移酶3（methyltransferase-like3，METTL3）具有促进m6A形成的作用，但只能在mRNA内不能使rRNA甲基化;而甲基转移酶4（methyltransferase-like4，METTL4）与METTL3为同系蛋白，同样具有促进m6A修饰形成的作用;另外作为m6A writer复合物的有效成分，甲基转移酶14（methyltransferase-like14，METTL14）可与METTL3反应杂合，并且其也是RNA连接蛋白，可提高m6A writer的活性[4]。

目前可知的m6A eraser有脂肪和肥胖相关蛋白（fat-mass and obesity-associated protein，FTO）、Alk B同源蛋白 5（AlkB homolog 5，ALKBH5）以及一些适配因子，如WT1 蛋白相关蛋白（Wilms tumor 1-associated protein，WTAP）、RNA 结合基序蛋白 15（RNA-binding motif protein 15，RBM15）、YTH结构域（YTH domain，YTHs）和核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，HNRNPs）等[3，8]。这些m6A eraser通过多种方式结合RNA上的m6A来影响不同肿瘤的发生发展。其中，FTO是首个被发现的m6A去甲基转移酶，定位于核散斑，主要调节3′非翻译区的m6A，研究发现其在细胞内被敲低时，mRNA的m6A水平升高，相反当FTO过表达时，mRNA的m6A水平受到抑制[10]。FTO的探索中证实了m6A甲基化是一种动态可逆的过程，其不仅与肥胖相关，其诱导的慢性炎症还参与多种肿瘤的发生发展及预后[11～12]。AlkB亚家族中的ALKBH5的去甲基化活性具有卓越效率，并可调控mRNA的各种生物学过程，从而达到调控细胞存活、凋亡等多种生理功能。在核散斑体中ALKBH5的沉默会损害其mRNA的加工与输出[13～15]。

m6A reader可介导m6A的生理行为并调控RNA功能，其常见蛋白有真核起始因子3C（eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3）和YTH蛋白家族蛋白。目前研究较多的为YTH蛋白家族蛋白包括两种类型YTHDFs和YTHDCs。YTHDFs又分为3种亚型YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3;YTHDCs也分为2种亚型YTHDC1和YTHDC2[6]。当同一个转录样本未发生RNA甲基化时，YTH家族蛋白可与m6A优先结合。第一个被发现以m6A依赖的方式介导RNA衰变的m6A reader为YTHDF2[16]。作為核m6A读取器的YTHDC1，结合m6A在377及428位的色氨酸残基上。YTHDC2最早发现于HCV病毒基因组复制中并在人类细胞中表达较高，其通过缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）和twist家族BHLH转录因子1（twist family of basic helix-loop-helix transcription factor 1，TWIST）的翻译促进肿瘤侵袭转移[17～18]。另外，新型m6A阅读器胰岛素样生长因子2（IGF2）可识别GG（m6A）C序列靶向转录mRNA，彭伟等人[19]于2020年发现在NSCLC细胞中，在胞质及胞膜中发现IGF2BP1大量表达，且在组织水平肺癌组织与癌旁组织比较IGF2BP1表达增加。

3 m6A与非小细胞肺癌

据报道，多种癌症中发现m6A甲基化修饰表达均升高或降低，在癌症中其作用也在逐渐被探索发现。当前，在多种肿瘤的生长侵袭过程中m6A甲基化的研究是肿瘤生物学研究的热点之一。尤其在NSCLC的生长与侵袭过程中，m6A甲基化起着关键作用。m6A相关蛋白表达的异常与NSCLC恶性增殖、迁移、侵袭、转移和耐药等相关。因此，研究m6A修饰在NSCLC中的生物学功能，明确临床活检标本m6A调控蛋白的异常表达，鉴别m6A修饰的关键因子改变，对分析及了解NSCLC发病机制具有重要意义，可以为NSCLC的诊断治疗及预后评估提供理论依据[20]。后续研究中发现m6A调控因子可通过调控转录组靶蛋白或关键信号通路发挥其病理作用。

3.1 m6A writer与非小细胞肺癌

1997年，METTL3第一次在Hela细胞中提取被发现作为m6A“writers”发挥作用，其不仅可以促进m6A的合成，有两个SAM结合位点可与SAM结合，还作为甲基转移酶的重要亚基。因为METTL3在胞质和胞核均表达，所以m6A修饰可以发生在这两个部位。美国哈佛医学院的Richard I Gregory教授和其研究团队发现，在NSCLC细胞中METTL3可促进促癌基因翻译，通过在胞质中的METTL3与翻译起始元件ELF3b结合，提高多聚核糖体的合成，促使促癌基因过表达翻译，进而促进了NSCLC细胞的生长、增殖和侵袭[21]。2017年，魏文平等[22]在2012～2016年收集50例非小细胞肺癌标本，发现较高表达水平的METTL3生存率更低，中位生存期也较低;反之相反。即METTL3可促进NSCLC的进展，并增加患者预后不良的风险。DU的团队[23]研究METTL3的SUMO化，发现其可与METTL14和WTAP发生作用，抑制甲基转移酶活性，使mRNA中m6A甲基化修饰水平下降。同时在NSCLC细胞中发现当METTL3敲除时，可直接影响肿瘤细胞的增殖与转移。2018年报道在NSCLC中METTL3可与eIF3h发生作用，从而增强翻译，使癌基因转化且形成密集多核糖体，这一发现可作为NSCLC潜在的治疗靶点。DU等人[24]在前人研究基础上发现，miR-33a可通过靶向METTL3 mRNA抑制NSCLC的增殖。2021年，有研究报道了METTL3的表达水平对NSCLC患者PD-1抑制剂疗效可以作为预测标志物，为NSCLC靶向治疗的研究打开了新的大门[25];同年徐朝久等[26]通过收集NSCLC患者癌组织及癌旁组织比较两组中METTL14含量，发现METTL14在癌组织中表达高，尤其TNM分期较晚且淋巴结转移的NSCLC组织中METTL14表达更高。

3.2 m6A eraser与非小细胞肺癌

近年来层出不穷关于FTO基因表达与NSCLC的关系的研究。LI等[10]研究发现在人NSCLC组织和细胞系中FTO表达与m6A含量呈负相关;当敲低FTO表达后，NSCLC细胞增殖速度降低;裸鼠实验同样发现FTO低表达可降低NSCLC细胞在裸鼠体内的增殖侵袭速度。LIU等[11]研究发现，在过表达野生型及突变型FTO基因中，仅有野生型FTO可以促进NSCLC细胞的生长及侵袭，而突变型由于去甲基化功能的丢失没有此作用。进一步实验发现，FTO蛋白可通过降低MZF1 mRNA转录本m6A水平及提高MZF1 mRNA的稳定性，可使MZF1高表达，从而促进NSCLC细胞侵袭转移。此外，该研究还发现FTO基因高表达与肺鳞癌的不良预后有关，肺鳞癌组织中FTO基因高表达患者的总生存期（overall survival，OS）较FTO基因低表达患者短[11]。而BRENNAN等[27]在一项来自中欧和东欧的7000例人群的研究中发现rs9939609等位基因A与肺癌患病风险降低有关。丁雨迪[28]通过从人类蛋白质图谱门户网站公布的数据调查及UALCAN数据库发现，FTO在肺组织中比脂肪组织表达量更高;在NSCLC中，癌旁组织FTO表达高于癌组织，且FTO表达下调后肺腺癌存活率也显著降低。肺癌发病类型中大部分为NSCLC，研究人员通过对TCGA数据库分析后确定FTO可作为NSCLC的预后影响因素。后续实验中敲低FTO基因发现FTO可通过下调MZF1 mRNA甲基化修饰的丰度，增强MZF1的稳定性，促进细胞增殖，诱导肺鳞状细胞癌发生。也有文献报道，FTO通过调控USP7 mRNA甲基化修饰丰度促使NSCLC发生[10]。2020年，孙泽龙[29]收集了97对肺癌患者的癌组织及癌旁组织，经分析发现RNA去甲基化酶ALKBH5在癌组织中低表达，后续将ALKBH5与TGFβ1信号通路相联系，通过过表达和瞬时敲低ALKBH5的方法，验证了ALKBH5可抑制NSCLC的生长、增殖、侵袭及转移。在2020年，CHEN等人[13]研究发现PVT1作为ALKBH5靶点介导了ALKBH5在骨肉瘤（osteosarcoma，OS）生长中的致癌性，并提示ALKBH5和PVT1可能成为OS治疗的新靶点。

3.3 m6A reader与非小细胞肺癌

现研究发现m6A reader YTHDF1在NSCLC组织和细胞株中均高表达。在NSCLC细胞株中敲低YTHDF1[30]，可使细胞周期蛋白CDK 2、CDK4和cyclinD1的翻译效率降低，阻滞NSCLC细胞在G0期/G1期，其可明显抑制NSCLC细胞的恶性增殖[17]。SHI的研究团队发现与低海拔动物相比，西藏地区的人和哺乳动物的YTHDF1作为高海拔适应基因之一在NSCLC中显著扩增，并且發现YTHDF1缺失后可调控CDK2、CDK4及cyclinD1的翻译效率抑制NSCLC增殖及转移，也可抑制新生肺腺癌（ADC）的进展。总而言之，缺氧适应下YTHDF1在NSCLC发病机制中起关键作用[17]。SHENG等[31]发现YTHDF2在NSCLC组织中表达过量，后识别结合磷酸戊糖途径中的关键酶6-PGD 3UTR的甲基化位点，促进其翻译，加速磷酸戊糖途径代谢，为NSCLC的增殖提供原材料。2020年，ZHOU等人[18]在研究内皮细胞（ECs）-细胞外囊泡（Evs）释放的miR-376c对NSCLC发生发展的抑制作用，同时也发现了ECs来源的Evs传递miR-376c可以导致YTHDF1的低表达和Wnt/β-catenin通路的阻断，更进一步证实YTHDF1缺失可以抑制NSCLC细胞增殖和新生肺腺癌的进展。

4 总结

现有研究可以得知，m6A甲基化修饰在多种肿瘤的发生发展预防诊断有着重要的地位。参与m6A甲基化调控的相关蛋白通过基因的剪接、出核、降解和翻译等过程参与不同恶性肿瘤的发生发展。虽然关于m6A的研究已经越来越完善，但是仍然存在许多未被探索的领域：（1）在哺乳动物或人类的体内是否有未经发现的与m6A甲基化修饰相关的调控蛋白，这些蛋白如何参与在生命活动及m6A的调控中;（2）目前发现的m6A甲基化修饰相关的调控蛋白是经过何种通路，通过什么方式参与到m6A甲基化修饰的调控中，且这些蛋白之间是否产生相互作用，如何作用;（3）除已发现的m6A相关蛋白在NSCLC中的调控作用，还有哪些蛋白参与到NSCLC中的调控中，又分别起到什么作用;（4）关于这些m6A相关蛋白在肺癌中的研究已经颇有成效，但还未有蛋白相关药物对NSCLC疗效研究的报道，其次抗癌药物耐药也是一个艰难的探索。

参 考 文 献

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（收稿日期：2021-07-09 修回日期：2021-11-08）

（编辑：潘明志）