樊有存，张红岩，杨旭升，韩 芊，刘玉皎，武学霞，*

(1.青海大学 农林科学院 省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810000； 2.青海大学 生态环境工程学院，青海 西宁810000)

土壤盐渍化严重制约着植物的生长发育和作物产量，我国约20%的耕地面积受到土壤盐渍化的影响。蚕豆(L.) 作为我国重要的食用豆类作物之一，其生长也易受到盐胁迫制约。蚕豆鲜草营养元素丰富，作为绿肥还田后能使得土壤有机质含量、全氮含量、水解氮、速效磷及速效钾的含量明显升高，并能很好地中和土壤碱性。将蚕豆根系分泌物添加到碱性土壤，能有效降低土壤碱解氮含量和pH值，而土壤有效磷、铁、锌及速效钾含量和微生物数量均显著增加。蚕豆可以种植在全盐含量小于0.5%的沿海盐碱土壤中，其生育中后期的抗盐碱性可能强于豌豆。综上所述，蚕豆可作为良好的耐盐作物进行育种，而解析蚕豆离子调控等耐盐基因功能为培育耐盐蚕豆新品种提供重要的理论基础。

盐胁迫对植物的影响主要通过渗透胁迫和离子毒害产生，而Na导致的离子毒害和盐胁迫引发的植物对K的吸收匮乏也是重要原因。植物主要通过各类质膜上的离子泵、共转运体和离子通道与环境进行离子交换，其中高亲和性K转运蛋白—HKT(high affinity Ktransporter)转运蛋白是一类与植物耐盐性相关的Na与K转运蛋白或Na/K共转运体。植物HKT家族主要包含两个亚家族，即亚家族Ⅰ和亚家族Ⅱ。亚家族Ⅰ广泛分布于双子叶植物中，具有 Na转运特性；亚家族Ⅱ主要分布于单子叶植物中，具有Na/K协同转运活性。近年来，研究人员在多种植物中均克隆获得了HKT家族成员基因，其中也不乏豆科植物。大豆中共发现4个基因，均属于第Ⅰ亚组。Chen 等从大豆中克隆获得1;1，1;4等基因，1;1表达量在经150 mmol·LNaCI处理的大豆根与叶中显著上升，而1;4在NaHCO及NaCl胁迫下的大豆根部组织中表达量显著上升；将1;1过表达至烟草中，能够显著提高转基因烟草的耐盐性，而将1;4转化至烟草后，烟草具有良好的抗NaHCO及NaCl的生长表型，且植株内积累了较多的K，而Na含量则较少。

在蚕豆中，关于耐盐功能基因HKT 家族基因的序列及功能解析尚未有报道。本研究依据本课题组前期的蚕豆耐盐转录组数据，筛选出标注为6的Unigene，以盐胁迫下的蚕豆叶片为材料，扩增获得蚕豆HKT家族成员基因1;1，并且对其进行生物信息学分析和基因表达特性分析。本研究有助于解析蚕豆HKT家族基因在耐盐离子调控中的功能，也为蚕豆耐育种工作提供候选基因与理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验所用材料由青海大学农林科学院提供。将筛选获得耐盐性能优良的蚕豆种质2013-04种子，用 5% NaClO消毒处理，置于植物光照培养箱黑暗萌发10 d后选择长势一致的幼苗，移至装有石英砂的塑料盆中并置于培养箱培养，培养条件为25 ℃ 光照/18 ℃ 黑暗，相对湿度 70%±5%，光周期 16 h光照/8 h黑暗，光量子通量密度(PPFD) 250 μmol·m·s，待完全长出真叶后，分别用 0、50、100、150 mmol·LNaCl溶液于每天同一时间对蚕豆幼苗进行灌溉处理，并记录生长状况。用于荧光定量的实验材料用以上浓度的NaCl溶液每隔2、4、8、12、24 h进行处理，然后分别取蚕豆幼苗叶片与根部于液氮速冻，后置于-80 ℃保存备用。

1.2 试剂及仪器

主要试剂：RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)，PrimeSTARMax DNA Polymerase高保真扩增酶、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒(TaKaRa)，载体pTOPO (北京艾德莱生物科技有限公司)。主要仪器设备有：梯度PCR仪(VeritiSimpliAmpProFlex 96，ABI)，低温高速离心机(Centrifuge 5430 R，Eppendorf )，超微量核酸蛋白测定仪(Implen NP80 Mobile，Implen)，实时荧光定量PCR仪(LightCycler480，Roche)等。

1.3 RNA提取及cDNA合成

取蚕豆组织50～100 mg，按照试剂盒说明书进行总RNA提取。使用超微量核酸蛋白测定仪测定总RNA浓度及纯度，使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。选用质量合格的总RNA进行cDNA反转录合成，-20℃保存备用。

1.4 基因扩增

以转录组注释的6的Unigene为模板，采用Prime Primier 5.0设计基因扩增引物VfHKTF：5′-AATATCTTAAATTCTTTTTTG-3′和VfHKT R：5′-CTAGAGAAGTTTCCATGGCT-3′，引物由天津金唯智生物科技有限公司合成。以反转录合成的cDNA为模板，使用PrimeSTARMax DNA Polymerase高保真扩增酶进行目的基因扩增。将扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化后连接至pTOPO载体上，转化至大肠埃希菌DH5α中，挑取单克隆进行菌液PCR验证，阳性克隆进行测序。

1.5 序列分析及HKT蛋白生理特性分析

开放阅读框ORF预测：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/；蛋白比对：Blast在线软件https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi；进化树分析：MEGA 5.0；蛋白的氨基酸组成：ExPasy-Protparam在线软件https://web.expasy.org/protparam/；信号肽预测：SignalP-5.0在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；跨膜结构预测：TMHMM Server v.2.0在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/；蛋白保守结构域分析：CDD在线软件https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi；蛋白二级结构：SOPMA 在线软件https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html；蛋白三级结构：SWISS-MODEL在线软件 https://swissmodel.expasy.org/。

1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

实验选用蚕豆1基因为内参基因(表1)，用NCBI Primer-BLAST在线软件设计了4对用于检测1;1基因的qRT-PCR引物(表1)，其中引物HKT1-889F与HKT1-1069R扩增效率高，条带单一，且熔解曲线显示单一信号峰，被用于后续实验。利用实时荧光定量PCR仪LightCycler480，采用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒进行qRT-PCR分析。程序设定为：95 ℃预变性30 s，1个循环；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环；95 ℃，5 s，60 ℃，1 min，进行熔解曲线分析；50 ℃降温30 s，实验设定3个重复。

2 结果与分析

2.1 蚕豆材料培养

将黑暗条件下萌发7 d的蚕豆幼苗移至盛有石英砂的花盆中，用不同浓度的NaCl溶液于每天同一时间对幼苗进行定量灌溉处理，结果显示，盐胁迫严重影响蚕豆植株的生长，且处理时间越长，盐浓度越高，植株生长受损越明显(图1)。本课题组前期的蚕豆抗盐转录组数据结果表明，在100 mmol·L的NaCl溶液处理7 d的蚕豆幼苗根部中能明显检测到蚕豆HKT成员基因表达，说明蚕豆HKT成员基因表达可能受盐胁迫诱导，所以本实验收集了100 mmol·LNaCl处理7 d后的蚕豆幼苗根部用于总RNA提取及基因克隆。

2.2 目的基因的扩增

根据转录组数据注释的6基因的Unigene，设计引物VfHKT-F与VfHKT-R。以盐胁迫处理的蚕豆幼苗根部为材料提取总RNA并进行逆转录，以逆转录后的cDNA为模板，扩增获得一段长度为2 024 bp的序列(图2-A)，将该序列连接到pTOPO载体上，挑取阳性克隆进行测序(图2-B)。将测序获得序列进行开放阅读框ORF预测，结果显示，该片段包含一个完整的ORF，该完整ORF长度为1 659 bp，包含 552个氨基酸(图3)。该基因序列信息已经提交至GenBank数据库，序列编号为MT740279.1。将该蛋白序列用NCBI数据库Blast在线软件进行比对，确定该蛋白是HKT蛋白，且暂时命名为VfHKT1。

表1 qRT-PCR引物序列

A，不同浓度盐处理下的株高(标尺=3 cm)；B，不同浓度盐处理下的叶片表型(标尺=2 cm)。A，Plant height of faba bean under different NaCl concentrations(bar=3 cm)；B，Leaf area of faba bean under different NaCl concentrations(bar=2 cm).图1 不同浓度NaCl处理7 d后的蚕豆幼苗Fig.1 Seedlings of faba bean irrigated with different concentration of NaCl for 7 days

2.3 生物信息学分析

2.3.1 植物VfHKT1;1蛋白进化树构建与分析

高亲和性K转运蛋白(HKT)是普遍分布于植物、细菌及真菌中的一类离子通道。为了比较蚕豆VfHKT1蛋白与其他植物中该蛋白的亲缘关系，使用MEGA 5.0进行进化分析。进化树分析表明VfHKT1蛋白属于HKT第Ⅰ亚家族(图4)，按照Plantten等和Hauser等对HKT家族的命名规则，将该基因命名为VfHKT1;1，其中分号前面的数字代表该基因属于第Ⅰ亚家族，分号后面的数字代表发现的顺序编号。进化树结果显示，蚕豆VfHKT1;1与蒺藜苜蓿()MtHKT1;1的进化关系较近(图4)。

2.3.2 VfHKT1;1氨基酸组成

蛋白的氨基酸组成根据其功能往往具有特异性，ExPasy-Protparam软件分析结果表明，VfHKT1;1蛋白相对分子质量为62.7 ku，理论等电点为9.26，其氨基酸组成如表2所示，其中亮氨酸含量最多(80，14.5%)，其次为丝氨酸(54，9.8%)、异亮氨酸(46，8.3%)、赖氨酸(42，7.6%)、苯丙氨酸和缬氨酸(38，6.9%)。带负电荷残基数为(天冬氨酸+谷氨酸)37，带正电荷残基数为(精氨酸+赖氨酸)55。不稳定指数为31.17(<40)，说明该蛋白较为稳定。

A，VfHKT1基因扩增；B，VfHKT1基因阳性克隆菌落鉴定。1、2、3和4均为PCR产物。A，Cloning of VfHKT1 gene；B，Identification of positive colonies of VfHKT1 gene. 1， 2， 3 and 4 represented PCR products.图2 VfHKT1基因扩增及鉴定Fig.2 Cloning of VfHKT1 gene and identification of the positive clone

图3 VfHKT1氨基酸序列Fig.3 Amino acid sequence of VfHKT1

星号标记的为蚕豆VfHKT1;1 蛋白。Asterisk indicated the VfHKT1;1 of faba bean.图4 VfHKT1;1与其他高等植物HKT蛋白的进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of VfHKT1;1 with other HKT transporters from higher plants

表2 VfHKT1;1蛋白氨基酸组成

2.3.3 VfHKT1;1蛋白信号肽与跨膜结构分析

信号肽是决定分泌蛋白分选途径的重要决定因子，所以是蛋白功能的重要组成部分。SignalP-5.0软件分析结果显示，VfHKT1;1蛋白具有信号肽的概率为0.001 5(图5)，说明其不具有信号肽且不属于分泌蛋白。通过TMHMM Server v.2.0 在线软件对VfHKT1;1的跨膜结构进行预测，结果显示，该蛋白具有8个跨膜区域(图6)，说明该蛋白属于跨膜蛋白。采用CDD在线软件分析该蛋白的保守结构域发现，该蛋白含有HKT家族典型的保守结构域TrKH(图7)，由此推测VfHKT1;1是位于膜结构的离子转运蛋白。

2.3.4 VfHKT1;1蛋白结构分析

蛋白的功能和活性很大程度上取决于蛋白结构。利用SOPMA 在线软件分析VfHKT1;1 的二级结构(图8)，结果显示，该蛋白主要由α-螺旋(45.11%)、无规则卷曲(31.16%)、延伸链(16.67%)和β-转角(7.07%)组成。随后又使用SWISS-MODEL在线软件模拟该蛋白的三级结构(图9)，结果显示，该蛋白三级结构功能与钾离子转运体功能一致。

2.3.51;1基因表达特性分析

实时荧光定量PCR结果显示，正常生长情况下1;1基因能在蚕豆叶片与根部表达，但在根中的表达水平明显较高(图10-A)，说明1;1基因的表达具有明显的组织特异性。使用100 mmol·LNaCl溶液对蚕豆幼苗进行处理，盐胁迫能明显诱导蚕豆叶片中1;1基因的表达，且1;1基因在盐胁迫1 h后表达明显上调，随后随着处理时间的延长，其表达量逐渐下调(图10-B)。而在根中1;1基因的表达受到盐胁迫抑制，且该基因表达量随着盐胁迫时间延长而降低(图10-C)。

图5 VfHKT1;1信号肽预测Fig.5 Signal peptide prediction for VfHKT1;1

图6 VfHKT1;1跨膜结构预测Fig.6 Transmembrane domain prediction of VfHKT1;1

图7 VfHKT1;1保守结构域(CDD)分析Fig.7 CDD analysis of VfHKT1;1

图8 VfHKT1;1二级结构预测Fig.8 The secondary structure prediction of VfHKT1;1

图9 VfHKT1;1三级结构预测Fig.9 Three-dimensional structure predictions of VfHKT1;1

A，正常生长条件下VfHKT1;1基因在蚕豆根与叶片中的表达水平；B，NaCl处理下VfHKT1;1基因在蚕豆叶片中的表达水平；C，NaCl处理下VfHKT1;1基因在蚕豆根中的表达水平。图中所显示数值为平均数±标准差(n=3)，*，**分别表示在P<0.05和P<0.01水平上差异显著。A，The expression of VfHKT1;1 gene in faba bean root and leaf under normal conditions；B，The expression of VfHKT1;1 gene in faba bean leaf under NaCl stress；C，The expression of VfHKT1;1 gene in faba bean root under NaCl stress. Values were means±SD (n=3). *，** represented significant differences at P<0.05 and P<0.01，respectively.图10 蚕豆VfHKT1;1基因表达分析Fig.10 Relative expression level of VfHKT1;1 gene in faba bean

3 讨论

植物高亲和性K转运蛋白(high affinity Ktransporter， HKT)介导的Na转运及Na/K协同转运过程不仅是植物响应盐胁迫的重要机制，而且对维持植物内的Na/K平衡起着重要作用。HKT第Ⅰ亚家族分布于高等植物尤其是双子叶植物中，并且对Na的选择性强于其他阳离子。本研究首次从蚕豆中扩增获得一个高亲和的K转运载体，经过进化树分析发现该基因属于HKT第Ⅰ亚家族，因此命名为VfHKT1;1，且该蛋白序列与苜蓿MtHKT1;1高度同源，序列相似度高达87.54%。此前，研究人员也多次通过分析转录组数据发现蚕豆和蒺藜苜蓿的序列同源关系最近。生物信息学分析显示，VfHKT1;1蛋白不属于分泌蛋白，具有8个跨膜区域，这与植物HKT家族一般包含8个跨膜区域的典型特征相符，且HKT转运蛋白包含有4个跨膜MPM基序(membrane-pore-membrane motif)，1个MPM结构含有2个跨膜螺旋和1个P-loop环，因此VfHKT1;1属于跨膜蛋白。此外，VfHKT1;1含有HKT家族典型的保守结构域TrKH，其蛋白三级结构与枯草芽孢杆菌钾离子转运体KtrAB结构相近。以上结论表明，蚕豆VfHKT1;1是定位膜结构上的阳离子转运体，可能介导了蚕豆细胞内Na/K离子的转运。

不同植物HKT成员可能因承担着不同的细胞及生理功能，呈现不同的表达模式。本研究测定得知，蚕豆1;1基因在根部与叶片组织均有表达，但在根部表达量明显高于叶片组织，说明该基因在蚕豆植株内具有表达多样性。而关于1;1基因的表达多样性在多种植物中均有报道，例如拟南芥1;1在根部及叶片维管束中表达；水稻1;3基因在叶、叶鞘及茎中表达；1;4在地上部维管束中表达；1;5在根部和叶鞘中表达。

盐胁迫下，叶片中1;1基因在1h后表达量上调，可能是该基因参与了盐离子在叶片组织中的转运或卸载过程。而1;1基因在根部的表达量，随着盐胁迫时间的延长呈现下调趋势，这可能是因为该基因在根部参与了Na的转运，主要表现为在盐胁迫下表达下调以减少Na的摄入。因此，盐胁迫条件下1;1基因在叶片中表达量上调，而在根部的表达量呈下调趋势。当然，对于1;1基因的具体功能及其响应盐胁迫的分子机制还需大量工作验证，比如其组织定位、亚细胞定位、盐胁迫下的细胞内离子含量变化规律、转基因植株功能验证等等。本研究有助于解析蚕豆HKT家族基因在耐盐离子调控中的功能，也为蚕豆耐盐育种工作提供候选基因与理论基础。