李小兰，张 瑞，郝兰兰，王 鸿，2，*

(1.甘肃农业大学 园艺学院，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省农业科学院 林果花卉研究所，甘肃 兰州 730070)

植物经常遭受各种生物和非生物胁迫，如盐、干旱、寒冷、病原体和害虫等，这些胁迫直接或间接地影响植物的生长发育，从而影响植物的生产。由于植物的许多代谢途径都是在转录水平上调控的，转录因子通过与特定的顺式启动子元件结合，在植物应对这些胁迫的响应中起着重要作用。近年来转录因子越来越受到人们的关注，NAC转录因子对植物的生长发育和逆境胁迫应答均有重要调节功能，改变NAC转录因子的表达量，不仅可以缓解果实采收后的衰老，而且可以有效抵御各种非生物胁迫。

NAC转录因子家族是植物在应对不利环境胁迫中起重要作用的最大的特异性基因家族之一。NAC家族基因的名称来源于3个转录因子：NAM(no apical meristem)、ATAF1/2和CUC2(cup-shaped cotyledon)。NAC特定结构域位于NAC家族蛋白的N端区域，可分为5个亚结构域(A～E)，亚域C提供NAC转录因子的DNA结合能力。NAC蛋白的C端除具有保守的NAC结构域外，还具有一个转录激活或抑制活性的高度分化的转录调控区域，使NAC转录因子具有调控植物生长发育、果实成熟、叶片衰老、激素信号，以及生物和非生物胁迫应答的功能。由于NAC蛋白在植物生长发育过程中的重要作用，不少研究已经对拟南芥、水稻、大豆、白梨、苦荞、白杨、葡萄、梅花、西瓜等植物进行了全基因组分析。NAC蛋白在植物中的一个重要调控作用是提高植物的抗寒性，已有研究表明，在构树、莲藕、木薯、西瓜和白梨中都发现了数量不等的NAC抗寒基因。近年来，Zhuo等在梅花中发现了15个NAC抗寒基因。但是，目前为止对NAC基因在桃抗寒方面的作用尚未见系统报道。

桃(L.)是蔷薇科李属桃亚属果树，是我国重要的落叶果树之一，其果实色、香、味、质俱佳，具有很高的经济和营养价值，近年来颇受人们的喜爱。温度是影响桃产量和地理分布的关键因素。我国桃种植的北线是39°N～40°N，这些地区周期性发生冻害，对桃产量产生严重影响。桃中与抗寒相关的NAC转录因子的研究还比较少。武肖琦利用反转录技术获得与桃果实发育相关的72基因，在番茄中过表达72可以促进转基因番茄的果实发育，加速果实成熟。因此，挖掘抗寒相关基因，为桃抗寒育种提供新的候选基因，对桃产业的发展具有重要意义。本研究根据桃基因组提供的信息，对桃NAC基因数量进行了鉴定，并对其基因结构、基序组成、染色体定位，以及与拟南芥的进化关系等进行了研究。另外，采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分析了16个基因在低温处理不同时间的表达模式。

1 材料与方法

1.1 材料

以桃品种丁家坝为材料，于2020年9月下旬在甘肃省农业科学院桃园采集12枝直径(1±0.2)cm、长短相同、朝北直立生长的一年生带叶枝条。将枝条置于室温水培24 h，随后将枝条随机分为4组，用保鲜袋密封，于4 ℃培养箱中进行低温诱导。分别在0、2、6、12 h随机选取一组枝条采集叶片，选取从上往下数第7到第9片叶作为实验材料，立即用液氮冷冻，-80 ℃保存，用于后续实验。每组3个枝条分别作为3个重复。

1.2 方法

1.2.1 桃基因组中NAC基因的鉴定

从拟南芥基因组数据库中(TAIR)(http://www. arabidopsis.org/)下载拟南芥NAC家族基因的蛋白序列和CDS序列。在桃基因组数据库中(GDR)(https://www.rosaceae.org/)下载桃基因注释Excel文件，筛选结构域为PF02365和PF01849的基因，获得桃NAC候选基因。进一步运用Pfam(https：//pfam.xfam.org/search)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)软件确认桃NAC候选基因的保守结构域，最终获得桃NAC家族基因(简称)。利用在线网站(https://web.expasy.org/protparam/)对筛选的桃NAC家族基因进行理化性质分析。

1.2.2 基因结构与保守基序分析

利用MEGA 6.0程序(http://www.megasoftware.net/mega.php)的邻接法，使用蛋白序列构建系统发育树，Bootstrap replications设置为1 000。使用MEME在线软件(http：//meme-suite.org/tools/meme)对PpNAC蛋白序列特征进行分析，基序数量设置为8(motif1～motif8)。利用全长序列结合桃基因组注释信息文件进行基因结构分析，同时利用TBtools对基因结构和保守基序进行可视化。

1.2.3 系统发育和多序列比对

为了探究桃与拟南芥NACs的进化关系，采用Clustal W软件对桃和拟南芥NAC蛋白序列进行比对，并利用MEGA 6.0程序的邻接法(neighbor joining，NJ)(http://www.megasoftware.net/mega.php)构建系统发育树，参数设置为Poission模式、完全删除和1 000次重复。利用DNAMAN软件对蛋白序列进行多重比对。

1.2.4 染色体定位分析

根据基因在桃数据库中的位置，用MG2C软件(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)将所有基因定位到桃染色体上。

1.2.5 启动子顺式作用元件分析

使用TBtools软件结合桃基因组文件和基因结构注释信息文件提取基因转录起始位点上游2 000 bp的序列，使用Plant CARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcarehtml)进行启动子顺式作用元件预测，最后利用TBtools进行可视化。

1.2.6 qRT-PCR

依据顺式作用元件分析结果，选取16个含低温响应和逆境应答元件较多的基因，使用DNAMAN设计家族基因特异性引物(表 1)，并在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。cDNA合成采用Prime Script RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa)，并参照说明书进行。采用SYBR Green荧光染料法进行qRT-PCR反应，以作为内参基因。反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s；60 ℃ 60 s；50 ℃ 30 s，共40个循环。试验进行3次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 桃NAC基因的鉴定与理化性质

根据PF02365和PF01849结构域在桃基因注释Excel文件中搜索，共筛选出119个桃NAC基因家族成员。根据以往研究中提出的命名方法，将119个桃NAC基因命名为001～119。这些基因的基本信息如表2所示，包括桃基因组数据库中的注释号、染色体位置、氨基酸数量、分子量和等电点(pI)。119个基因除119位于染色体骨架上之外，其余基因均定位在桃的8条染色体上；编码的氨基酸数量在68(026)～862(PpNAC077)，平均氨基酸长度为352 aa；分子量为7.2(PpNAC026)～96.1(PpNAC077)ku，平均分子量为39.8ku；等电点在4.3(PpNAC019和PpNAC100)～9.5(PpNAC047)。

2.2 桃NAC基因家族的基因结构和保守基序分析

进化树结果(图1)显示，119个被划分为12个亚族(Ⅰ～Ⅻ)，每个亚族的成员数量为1～22。其中，第Ⅹ亚族成员数量最少，只包含1个基因；第Ⅰ亚族成员数量最多，包含22个基因。为了鉴定的结构多样性，分析了单个基因序列中的外显子-内含子数量。结果(图1-B)显示：19个基因没有内含子，除026外均处于第Ⅷ和第Ⅸ亚族中；其余基因至少包含1个内含子(005、017、023、034、069、071、086、091、092、095)，最多包含9个内含子(029)。同一亚族内的基因内含子数量和长度基本一致，例如，第Ⅵ和第Ⅶ亚族中除了少数基因外，大多数基因都含有2个内含子，第Ⅷ和第Ⅸ亚族中多数基因不含内含子。

表1 引物信息

表2 桃NAC家族基因成员的相关信息

续表2 Continued Table 2

续表2 Continued Table 2

由图1-A可以看出，motif1+motif8、motif5、motif4+motif2、motif6+motif3和motif7分别组成了NAC的子结构域A、B、C、D和E。进一步分析发现，大部分保守基序位于NAC结构域的N端区域，表明这些保守基序对的功能具有重要意义。从出现频率来看，motif1、motif3和motif7出现频率最高，几乎覆盖了从Ⅰ到Ⅻ的所有亚族，表明motif1、motif3和motif7是的重要保守基序。此外，聚集在同一亚族中的基序组成和排列顺序基本相同，推测特定的基序组成和排列顺序可能与不同亚族的特定功能有关。

2.3 PpNACs多序列比对与系统发育分析

对119个PpNACs的保守结构域进行分析可知，NAC结构域的子域A、C和D是保守的，而B和E是发散的(图2)。详细检查子域B和E发现，Ⅻ亚族序列的子域B和E都不保守。由于子域A、C、和D保守，推测他们在NAC家族基因的功能中发挥重要作用，发散的子域B和E可能与NAC家族基因的特定功能有关。

CDS中间的区域是内含子。The region in the middle of the CDS was intron.图1 PpNAC基因的基序分析(A)和基因结构(B)Fig.1 Gene structure and motif analysis of PpNACs in peach

图2 桃NAC的多序列比对Fig.2 Multiple sequence alignment of NAC in peach

通过系统发育树分析将桃和拟南芥的NAC分为18个亚族(a～r)(图3)。119个PpNACs分布在除亚族c、d和h外的15个亚族上，每个亚族包含1～23个成员。其中，p亚族包含成员数量最少，只包含1个，e亚族包含成员数量最多，有23个成员。进一步分析发现，拟南芥与桃之间存在一些密切相关的NACs(比如PpNAC005、PpNAC080和ANAC006，PpNAC118和ANAC74等)，这些PpNACs可能与拟南芥的同源ANACs具有相似的功能。

2.4 PpNACs基因的染色体定位分析

根据119个基因在桃基因组数据库中的位置，使用MapChart软件绘制了其在染色体上的分布情况，其中，118个基因不均匀地分布在1到8号染色体上，119被定位在未定位的支架上(scaffold-53)(图4)。2号染色体上分布的基因数量最多，占比21%；其次是4号染色体，占比18%；3号、5号和8号染色体分布的基因数量最少，分别包含8、11和11个基因。

☆，拟南芥；★，桃。☆，Arabidopsis; ★， Peach.图3 桃和拟南芥NAC家族成员系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of NAC family members in peach and Arabidopsis

2.5 PpNACs的顺式作用元件

在桃NAC家族基因起始密码子上游2 000 bp序列中共筛选出9种类型的顺势调控元件：(1)脱落酸响应原件298个；(2)光响应原件1331个；(3)茉莉酸甲酯响应原件382个；(4)防御和应激响应原件52个；(5)水杨酸响应原件84个；(6)低温响应原件92个；(7)生长素响应原件103个；(8)类黄酮响应原件10个；(9)赤霉素响应原件121个(图5)。推测NAC家族基因在桃应对生物与非生物胁迫响应发挥重要作用。

2.6 PpNACs在低温胁迫下的表达模式

挑选16个含低温响应和逆境应答元件较多的基因进行qRT-PCR分析，结果(图6)表明，4℃低温胁迫下，所选的16个基因的相对表达量在低温胁迫不同时间均表现为上调；015、037、048和064在低温胁迫2 h时，与对照相比表达量上调不明显；与低温处理2 h相比，048、052、077和117在低温处理6 h时表达量上调不显著；在低温处理12 h时，所有的基因相对表达量与对照相比均显著上调。表明桃NAC转录因子家族可能在桃的抗寒过程中发挥重要功能，并且需要在一定时间的低温胁迫后才能显著上调表达。

3 结论与讨论

植物特异性NAC转录因子是植物中最大的转录调控家族之一，在植物的生长发育调控和逆境响应中发挥重要作用。由于NAC基因在植物中的重要作用，许多NAC转录因子已经在拟南芥、水稻、杨树和甘蔗等模式植物和非模式植物中进行了全基因组鉴定和功能表征。本研究通过全基因组分析，共鉴定了119个基因，并将其命名为001～119。基因家族成员数量多于马铃薯(110个)、拟南芥(105个)、大豆(101个)、木薯(96个)、葡萄(79个)和甘蔗(88个)，少于水稻(151个)和杨树(163个)，成员数量的大小差异可能是由于各物种进化和分化过程中的全基因组多倍体事件造成的。

图4 桃NAC家族基因的染色体定位Fig.4 Chromosomal localization of NAC family genes in peach

图5 桃NAC家族基因的顺式作用元件Fig.5 Cis-acting elements of NAC family genes in peach

PpNAC家族成员在基因长度、蛋白质分子量和等电点等方面存在较大差异，但基因结构相对保守。根据家族成员聚类关系，将所有的蛋白分为12个亚族。同一亚族的成员关系密切，具有相似的外显子/内含子结构和位置，推测可能在桃的生长发育和逆境响应中具有相似的功能，这与前人对白梨和亚洲梨的研究结果基本一致；但同一亚族成员之间也存在一定的差异，如外显子的大小、相对位置和数量等，例如，第Ⅱ亚族中077的外显子数量多于同一亚族中其余成员数量，并且同一亚族中094的外显子数量明显多于其他成员。这一结果可能是由于进化过程中基因片段的剪接或插入，产生了新的基因功能所致。此外，同一亚族大多数成员的motif数量和排列顺序基本相似，表明这些蛋白质具有保守功能，这与NACs相关功能被很好的保存的结果相印证。由于拟南芥的NACs基因研究较深入，根据拟南芥NACs基因的同源性预测PpNACs的功能和进化关系，所有的NAC蛋白被分为18个亚族(a-r)，并且聚类在同一分支中的基因具有功能多样性，例如，31、92和98属于q亚族，它们不仅与植物衰老和顶端分生组织的形成有关，而且与器官的形成有关；值得注意的是，c、d和h亚族中没有包含PpNAC成员，而b、e和m亚族中没有发现任何拟南芥的NAC成员，这表明NAC在各个物种中的进化存在差异。氨基酸序列比对和保守基序分析发现，motif1+motif8、motif6、motif3+motif4、motif2+motif5和motif7分别代表NAC结构域的子域A、B、C、D和E。大多数桃NAC蛋白同时包含motif1-motif8基序，验证了NAC蛋白的高度保守性，但也有几个亚族的蛋白仅包含其中几种motifs，表明该亚族的基因可能具有不同的功能，这与苦荞中的研究结果一致。顺式作用元件分析表明，这些序列主要包含9类原件，占比较大的是光响应原件、逆境响应原件、低温响应原件和类黄酮响应原件，这些元件在桃生长发育和应对逆境胁迫过程中起到至关重要的作用。16个含低温响应与逆境应答元件较多的基因在低温胁迫下明显上调，猜测其可能参与桃对低温胁迫的响应。

图6 低温胁迫下桃NAC基因的表达水平Fig.6 Expression levelof PpNAC genes in peach under low temperature stress

综上，基因在桃对低温胁迫的响应中发挥了重要作用，因此可能成为桃抗寒性相关的候选基因。