伊风艳， 杨 鼎， 温 超， 晔薷罕， 巩 青， 吴玉霞， 布仁朝古拉， 张璞进

(1.内蒙古自治区农牧业科学院， 呼和浩特 010031； 2.卓资县农牧和科技局, 内蒙古 卓资 012300;3.内蒙古师范大学附属第二学校， 呼和浩特 010090)

硬实种子是指种皮致密、不透水或透水性差而导致不能吸胀发芽且保持原来大小状态的一类种子，该类种子常见于豆科、百合科、旋花科、锦葵科、山茶科等植物种子中，但以豆科种子硬实现象最为普遍[1-4]。种子硬实是植物的一种休眠形式，能使物种避免不良环境的影响，长时间保持其生活力，保持物种的正常繁衍，对种质资源的保存和促进植物远距离传播十分有利，但在农业生产实践中会导致幼苗建植难、出苗不整齐等问题[5-7]。因此，在科研试验及农业生产利用中，掌握种子硬实原因和解除硬实方法一直是种子科学研究的热点问题。针对种子硬实问题，国内外学者开展了大量研究，主要包括物理方法、化学方法和生物方法[8-9]。在实际应用过程中，不同植物种子由于硬实程度、种皮厚度等存在较大差异，最优处理措施也不尽相同。

扁蓿豆(Medicagoruthenica)是豆科苜蓿属多年生草本植物，具有广适性和极强的抵抗干旱、低温、盐碱胁迫的能力，可在干旱、石质和沙漠环境生长，是唯一能够在青藏高原高寒地区生长的苜蓿属多年生豆科植物，也是我国土壤贫瘠地区必不可少的优质牧草之一[10-13]。扁蓿豆在草地改良、生态治理及牧草育种中具有重要意义。扁蓿豆种子与其他豆科牧草种子一样，存在严重的硬实现象，种子硬实率高达80%以上，自然发芽率只有20%[14]，这种硬实特性严重影响其在生产与研究中的直接利用。为此，李悦煊[15]、杜建才等[16]分别采用不同方法对细叶扁蓿豆以及扁蓿豆品系(90-36)种子硬实破除开展了相关研究。本试验以野生扁蓿豆种子为材料，采用物理方法和化学方法处理种子，开展不同处理下种子萌发特性的研究，旨在探讨适宜破除扁蓿豆种子硬实的最佳方法，为扁蓿豆新品种培育、栽培技术研究及其推广利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

扁蓿豆种子于2019年采集于内蒙古通辽市科尔沁沙地。

1.2 试验方法

1.2.1种子基本性状

挑选发育良好且成熟饱满的种子置于解剖镜下，观察其性状、颜色、表面纹理等特征；用游标卡尺测量其长、宽、厚，10次重复；选取 1 000 粒种子，用万分之一天平测定种子千粒重，3次重复。

1.2.2种子的硬实率测定

随机选取净种子100 粒浸泡于45 ℃温水中，自然冷却，浸泡24 h，统计未吸胀的种子数，计算种子的硬实率，3次重复。

1.2.3种子硬实的破除

1) 物理破除法

打磨处理：取一定量饱满干净的种子，利用砂纸打磨，直至种子表面失去光泽、出现砂划的痕迹，进行萌发试验。

切破处理：取一定量饱满干净的种子，用解剖刀切破胚根相对端种皮，注意在处理过程中不得伤胚，处理完进行萌发试验。

热水浸种处理：将一定量饱满干净的种子分别置于温度为60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的水中，设置浸泡时间为5 min和10 min，取出待水自然冷却到室温后，置于滤纸上晾干后进行萌发实验。

低温浸种处理：将一定量饱满干净的种子分别置于液氮中处理5、10、15、20、30、40 min，取出进行萌发试验。

2) 化学破除法

98%浓硫酸处理：将一定量饱满干净的种子放入小烧杯中，利用98%的浓硫酸溶液分别处理种子5、10、15、20、25、30、40 min，用玻璃棒搅拌，使种子充分接触硫酸溶液，达到处理时间后，立即取出用蒸馏水反复冲洗直至将浓硫酸完全去除，置于滤纸上晾干后进行萌发试验。

盐酸溶液处理：将一定量饱满干净的种子放入100 mL的三角瓶中，利用浓度为20%的HCl溶液分别处理种子20、40、60、80、100 min，处理期间三角瓶用封口膜封口并不断摇晃，使种子充分接触溶液，达到处理时间后，取出用蒸馏水冲洗干净，置于滤纸上晾干后进行萌发试验。

氢氧化钠溶液处理：将一定量饱满干净的种子放入小烧杯中，利用30%的氢氧化钠溶液分别处理种子1、2、3、4、5、6 h，处理期间用玻璃棒不断搅拌，使种子充分接触溶液，达到处理时间后，立即取出用蒸馏水反复冲洗直至将氢氧化钠溶液完全去除，置于滤纸上晾干后进行萌发实验。

1.2.4标准发芽试验

将处理后的种子均匀摆放于铺有双层滤纸直径为90 mm培养皿中，置于12 h/12 h(光/暗)，温度为(25±2)℃的光照培养箱中进行萌发试验，4 次重复，每重复50粒种子，并设置对照(未做任何处理，ck)。第 4天初次计数，第14 天统计正常幼苗数和硬实种子数，计算发芽势、发芽率、硬实率和霉变率。

发芽势(%) =(前4 d正常发芽的种子数/供试种子数)×100%；

发芽率(%) =(14 d内正常发芽的种子数/供试种子数)×100%；

硬实率(%) =(14 d未吸胀的种子数/供试种子数)×100%；

霉变率(%) =(霉变的种子数/供试种子数)×100%。

1.3 数据处理

利用Microsoft Excel 2010软件进行数据处理与作图，利用SAS软件进行单因素显著性分析。

2 结果与分析

2.1 种子形态特征

扁蓿豆种子为椭圆形，种皮黄褐色或褐色，种脐位于一侧，表面较光滑，长度(2.971 4 ± 0.179 0)mm，宽度(2.057 1±0.145 0)mm，厚度(0.971 4±0.109 7)mm。千粒重(3.447 8±0.050 9)g，平均硬实率92.5%。

2.2 切割和打磨处理对破除扁蓿豆种子硬实的效果

扁蓿豆种子在自然状态下存在严重的硬实现象，未经处理的扁蓿豆种子发芽率为9.00%左右，硬实率高达91.00%。但经过砂纸打磨和切割处理后，扁蓿豆种子的硬实率显著下降(p<0.05)。经过适度的砂纸打磨，种子的发芽势、发芽率均比对照显著提高了74.00%和73.50%，硬实率显著降低了84.50%，但种子霉变率显著提高；经过切割处理，种子硬实率降为0，硬实完全被破除，发芽率达99.00%，与对照相比显著提高了90.00%，只有1%的种子发生死种现象。

2.3 热水浸种处理对破除扁蓿豆种子硬实的效果

由表1可知，经过不同温度的热水处理，种子的发芽率、发芽势与对照组相比均有所提高，硬实率有所降低。总体来看，随着处理水温的提高，扁蓿豆种子的发芽率、发芽势均呈上升趋势。60 ℃和70 ℃处理下，种子萌发的各项指标与对照无显著差异；80～100 ℃处理下，种子发芽率和发芽势均显著高于对照，硬实率显著降低，在100 ℃下浸种5 min时达到最大发芽率(77.00%)和最大发芽势(74.00%)，硬实率降低到12.00%，但霉变率显著升高；而在100 ℃下浸种10 min，发芽率和发芽势呈现显著降低，霉变率显著升高。由此可见，100 ℃热水浸种5 min对扁蓿豆种子打破硬实效果较好。

表1 热水浸种处理对破除扁蓿豆种子硬实的效果Table 1 Effects of hot water soaking on breaking hardness of M. ruthenica seeds

2.4 低温处理对破除扁蓿豆种子硬实的效果

与对照相比，经液氮处理5～40 min，种子的发芽势、发芽率均显著提高(p<0.05)，硬实率显著降低(表2)。各处理时间下的指标差异基本不显著，处理时间为30 min时种子的发芽率达到最高，为71.00%，比对照提高了62.00%，硬实率显著降低到26.50%，比对照降低了64.50%。试验中发现，随着液氮处理时间的延长，萌发后的幼苗根系和子叶受到的影响越大，根系逐渐缩短甚至出现不同程度的断裂现象，子叶从培轴上掉落。由此可见，液氮处理虽然能破除扁蓿豆种子的硬实，提高其发芽率，但对种苗也造成了很大的伤害。

表2 液氮处理破除扁蓿豆种子硬实效果Table 2 Effects of liquid nitrogen treatment on breaking hardness of M. ruthenica seeds

2.5 98%浓硫酸处理对破除扁蓿豆种子硬实的效果

98%浓硫酸破除硬实主要是利用其强氧化性，腐蚀并破坏种皮结构，使种子能够吸水萌发。由表3可看出，98%浓硫酸浸种不同时间对扁蓿豆的发芽势、发芽率和硬实率均产生了不同的影响。处理时间在0～15 min时，种子的发芽势、发芽率随着处理时间的延长均显著提高，硬实率显著降低，但处理时间达到15 min后，各处理时间之间种子发芽势、硬实率均无显著差异，而发芽率在处理时间为30～40 min时呈现降低趋势，霉变率显著升高，处理40 min时，霉变率高达9.50%，并且幼苗出现断苗、根系变粗等现象。综合各项指标以及种苗生长状态，利用98%浓硫酸打破扁蓿豆种子硬实比较合理的时间为20 min。

表3 98%浓硫酸处理破除扁蓿豆种子硬实效果Table 3 Effects of 98% sulfuricacid treatment on breaking hardness of M. ruthenica seeds

注：不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。下同。图1 切割和打磨处理对破除扁蓿豆种子硬实的效果Fig.1 Effects of cutting and grinding treatment on breaking hardness of M. ruthenica seeds

2.6 盐酸溶液和氢氧化钠溶液处理对破除扁蓿豆种子硬实的效果

由图2可知，利用20%HCl溶液浸泡对扁蓿豆种子的硬实破除效果均不理想。20%HCl溶液处理20 min时发芽率反而低于对照，当处理时间为40～100 min时，发芽率有所提升，但提升均未达到显著水平(p>0.05)，种子硬实率依然在88.00%以上。

由图3可知，30% NaOH 溶液浸泡不同时间，扁蓿豆种子的发芽率与对照相比均无显著的差异(p>0.05)。

图3 30% NaOH 溶液处理破除扁蓿豆种子硬实效果Fig.3 Effects of 30% NaOH treatment on breaking hardness of M. ruthenica seeds

3 讨 论

由于种皮具有发达的角质层、栅栏状细胞和骨状石细胞，使种皮的透水透气性较差，对胚的生长产生机械束缚，导致种子不能萌发[17-19]，造成硬实现象。不同的物种机械束缚和透水性不同，硬实程度也存在一定差异，所以，破除硬实的最佳处理方式也会有所不同。关于硬实的破除研究已有大量的报道，物理方法(划破种皮、砂纸打磨、热水浸泡)或化学方法(强酸、强碱)等都能有效破除种子硬实[20-22]。本研究中，野生扁蓿豆种子的硬实率高达92.50%，采用划破种皮和砂纸打磨可使其硬实率降低到0和7.50%，该类方法虽然操作简单、安全，但耗时耗力，尤其不适宜处理大量种子，且砂纸打磨程度较难掌握，易导致种子受损死亡。

在农业生产中，热水浸种处理破除种子硬实更为实用。热水浸种，可以软化种皮，去掉种皮表层的蜡质和油脂，提高种皮的透水性和透气性，浸出种子内发芽的抑制物，促进种子萌发，操作简单、经济环保、效果显著，在实际应用中具有显著的优势。但不同种子破除硬实所需求的浸泡温度、浸种时间都有所不同，如刺槐种子在100 ℃热水中浸泡24 h[23]、美丽决明种子在40 ℃热水中浸泡30 min[24]、印度田菁种子在80 ℃热水中浸泡3 min[25]、任豆种子在70 ℃热水中浸泡30 min[26]均达到最佳破除效果。本研究中100 ℃热水浸种5 min，其发芽率可达77.00%，硬实率显著降低到12.00%，但有11.00%的种子出现糜烂现象，这一结果与杜建才等[16]对扁蓿豆品系(90-36)种子硬实破除研究结果一致，说明热水浸泡能够有效地打破扁蓿豆种子硬实现象，但对种子本身会产生一定的伤害。

液氮可用于储藏种子，也可用于解除种子的硬实。通过液氮处理可以增加种子的透性。本研究中经过不同时间的液氮处理，均能有效破除扁蓿豆种子的硬实，硬实率可降低到26.50%，但随着处理时间的延长，出现断苗断根现象。这一结果与前人在黄花苜蓿[22,27]、额济纳旗苦豆子[25]等种子上的研究结果一致，液氮浸种容易引起子叶柄、根系断裂，导致不正常苗增多。但也有研究表明，液氮处理能够有效破除紫花苜蓿、草木樨、百脉根等种子硬实，且对种子活力没有伤害[25]。由此可见，不同的物种由于种皮结构和内部结构不同，对液氮的反应也不同，因此，在实际操作中应根据物种选择适宜的处理方法。

浓硫酸具有强氧化性，浓硫酸浸种处理是破除种子硬实最常用的方法之一。通过98%浓硫酸处理，可使存在硬实的山地岩黄芪种子[28]、黄花苜蓿种子[21]、草木樨种子[29]、野大豆种子[30]的发芽率分别提高到96.67%、99.00%、100%、99.50%，但不同的物种处理的最佳时间存在差异。本研究中98%浓硫酸对破除扁蓿豆种子硬实效果也比较显著，经98%浓硫酸处理后，种子的硬实率逐渐降低，当处理时间为25 min，种子的发芽率高达96.50%，随着处理时间的延长，种子硬实被完全打破，但发芽率开始降低，种子腐烂坏死数增多，幼苗生长缓慢，该类现象在其他物种上也存在[22,31]。浓硫酸虽然增加了种皮的通透性，但强腐蚀会伤及种子内部组织，对种子产生毒害作用，进而导致该类现象的产生。

20%HCl溶液和30% NaOH溶液对破除扁蓿豆种子硬实作用很小或没有作用，其原因可能是种皮坚硬不透水导致溶液很难发挥作用。