王伟杰， 陈保国， 张远航， 马 平， 冯万军

(山西农业大学农学院， 山西 太谷 030801)

种子活力是种子具有的潜在萌发及耐贮藏的能力。高活力种子发芽迅速、出苗整齐、成苗率高，即使在高温、干旱等逆境条件下也可以保证苗全、苗壮和作物的田间密度[1]。目前，玉米单粒播种技术已经普及，高活力的种子是保证出苗率的基础，有助于发挥玉米的生长态势与产量潜力[2]。因此，种子活力是玉米生产过程中重要指标之一。迄今，已有多种有关种子活力检测的方法，归纳起来可大致分为直接法和间接法两类[3]。

种子成熟度是影响种子活力的重要因素[4]。研究发现，不同玉米品种授粉后35～49 d间收获的玉米种子干物质不再增加，基本达到生理成熟，发芽率均在90%以上。另有报道指出，玉米种子活力形成于种子生长发育的早期，如对授粉后15 d的玉米种子胚进行培养发现，60%以上的种胚已具备发芽能力[5]，但种子活力形成的关键时期应在种子的脱水阶段[6]。种子活力的形成与糖类、蛋白质和脂肪等化学组分的代谢密切相关。在种子萌发过程中，这些贮藏物质被降解为小分子物质以满足种子萌发过程中对物质和能量的需求，同时起到维持渗透平衡的作用[7-8]。

植物内源激素是调控种子休眠与萌发的重要因子。脱落酸(ABA)是种子休眠的主要诱导物和保护物[9]，过度积累会导致种子高度休眠[10]；而赤霉素(GA3)能够打破种子因ABA 含量过高引起的休眠[11]；细胞分裂素(CTK)在种子萌发中与脱落酸具有拮抗作用，CTK 可以逆转ABA 对种子萌发的抑制作用[12]，也可以与GA3互作诱导α-淀粉酶表达从而促进种子萌发[13]；生长素(IAA)正向调控ABA和负向调控GA3的生物合成与信号转导途径[14-15]，从而抑制种子萌发。

目前，有关糖类、蛋白质、氮素在不同成熟度的玉米种子中如何积累，以及各种激素含量在不同成熟度种子的萌发过程中发挥何种作用尚不清楚。因此，本研究在测定玉米自交系JNY 6 F不同成熟度种子中的可溶性糖、总氮含量的基础上，进一步利用标准发芽试验分析不同成熟度玉米种子活力差异以及萌动种子胚中的激素含量等生理特性变化，以期明确玉米种子生理特性与活力之间的关系，旨在为种子活力形成的生理机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以自主选育玉米自交系JNY 6 F为试验材料，于2020年4月底在山西农业大学农作站种植，种植行距0.5 m，密度4 500株/667 m2。在玉米吐丝前，选长势一致的植株将雌穗套袋，随后所有雌穗在同一天完成授粉。自授粉后20 d开始，每5 d 选取授粉充分的果穗。为了排除营养分配差异，手动剥离各果穗中部籽粒100粒。以3个果穗的籽粒混合作为1次重复，共3次重复用于生物量测定；另外5个果穗的籽粒混合作为1次重复，共3次重复，经自然晾晒干燥后用于后续种子活力分析。

1.2 生物量测定

收获的新鲜种子称重后，置于烘箱在120 ℃下灭活30 min，80 ℃下烘干至重量恒定，根据公式计算种子水分含量和含水率。

含水量(mg)=(鲜重-干重)/种子数目;

含水率(%)=[(鲜重-干重)/鲜重]×100%。

1.3 生理特性测定

从自然干燥的不同成熟度种子中，每重复取50粒，共3次重复，洗净后加入去离子水250 mL，浸泡24 h后用DDSJ-308 A型电导仪测定材料浸泡液电导率[16]。将自然干燥后的干种子磨碎，每重复取0.5 g，共3次重复，用80%乙醇对可溶性糖进行提取，采用经典蒽酮比色法对可溶性总糖测定[17]，采用3,5-二硝基水杨酸法进行可溶性还原糖测定[17]；采用H2SO4-H2O2靛酚蓝比色法测定N素含量[18]。计算蛋白质含量。

蛋白质含量=全N含量×F，式中，F为蛋白系数。

1.4 标准发芽试验

参照国家种子检验规程，从自然干燥的种子中取出100粒，用卷纸法置于光照培养箱，每日光照12 h/黑暗12 h处理，恒温 25 ℃条件下发芽，3次重复，每天统计发芽情况，第3天统计发芽势，第7天统计发芽率，第7天统计发芽率后在各重复中选取具有代表性的10株正常幼苗，分别测其幼苗鲜重和干重，并计算各萌发指标及活力指数。

发芽势(%)=(第3天发芽数/发芽试验样品粒数)×100%；

发芽率(%)=(第7天发芽数/发芽试验样品粒数)×100%；

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)，Gt为发芽试验终期内每日发芽数，Dt为发芽日数；

活力指数(VI)=GI×S，S为正常幼苗的单株干重。

1.5 内源激素含量测定

使用上海酶联公司生产的试剂盒(ml 147100、ml 020295、ml 062451和ml 064270)，参照说明，对不同成熟度玉米种子吸胀12 h后的种子胚中的IAA、CTK、GA3和ABA等4种激素分别进行检测，3次重复。

注：图A为不同成熟度玉米种子的外观形态；图B为不同成熟度玉米种子的干重、鲜重变化；图C为不同成熟度玉米种子的含水量及含水率变化；图上不同小写字母表示差异显著p<0.05。图1 不同成熟度玉米种子性状变化Fig.1 Traits changes of maize seeds with different maturity degree

1.6 数据分析

采用Microsoft Excel 2010软件处理数据；用DPS统计软件对数据进行统计分析，LSD(Least-Significant Difference)最小显著性差异法在0.05和0.01概率水平确定各平均值间的差异显著性，分析结果以平均数±标准差表示；用R语言中的cor、cor.mtest和corrplot函数分别对数据进行相关性分析、显著性检验和绘图。

2 实验结果

2.1 不同成熟度玉米种子生物量及水分含量变化

在授粉后35 d，JNY 6 F种子基部出现黑色层(图1 A)，此时种子达到生理成熟，种子鲜重也达到最大值，为351.29 mg，但是此后干物质仍在积累，在最后一次收获时干重为230.20 mg(图1 B)。另外，在授粉后20～35 d，是干物质积累的快速时期，单个种子的干重从82.07 mg增加至202.96 mg，共提高了147%，平均每天增加8.06 mg(图1 B)。待种子生理成熟后，生物量虽仍在积累，但增长速率较缓慢，45 d相比于35 d仅增加了27.24 mg，平均每天增加2.72 mg(图1 B)。与之对应，在授粉后20～35 d，单个种子绝对含水量缓慢降低，从162.91 mg降至148.33 mg，降幅在9%，而授粉后35～45 d，单个种子绝对含水量急剧减少，最终含水量降低了64%，种子含水率从70%左右降至20%左右(图1 C)。

2.2 不同成熟度干燥玉米种子的生理特性变化

在玉米自交系JNY 6 F不同成熟度收获后经自然干燥的种子中，可溶性总糖含量呈先快速增长后缓慢降低的变化趋势，而可溶性还原糖和总蛋白质含量则呈先快速生长后趋于稳定的变化(表1)。由表1可见，授粉后20～35 d的种子收获后经自然干燥处理，其体内的可溶性总糖和可溶性还原糖的含量分别从4.24 mg和1.65 mg增至9.13 mg和4.60 mg，分别提高了150%和179%，平均每天积累量为0.33 mg和0.20 mg，但在授粉后45 d的种子收获后经自然干燥处理，其体内的可溶性总糖和可溶性还原糖的含量则分别降低了9%和提高了7%，平均每天积累量分别为-0.08 mg和0.03 mg。与之不同，单粒种子的总蛋白含量是在授粉后20～30 d的干种子中快速增长变化，从8.40 mg增加至20.33 mg，增加了142%，平均每天增加1.19 mg，而在授粉后30～45 d的干种子中，单粒种子中的总蛋白含量仅增加了19%，平均每天积累量仅为0.26 mg。

表1 不同成熟度干燥种子中生理指标测定结果Table 1 Measurement results of physiological indexes in dried seeds of different maturity degree

2.3 不同成熟度干燥玉米种子的活力差异比较

发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数是反映种子活力的重要指标。发芽率可以反映种子的萌发能力，发芽势与发芽指数可以反映出种子的发芽快慢，活力指数不仅可以反映发芽快慢而且还可以反映幼苗长势。通过发芽试验研究发现，玉米自交系JNY 6 F授粉后20 d的种子已具备发芽能力，发芽率在44%左右，但是其发芽势、发芽指数和活力指数均最低，分别在36%、37和0.6左右，而授粉后25 d的种子发芽率已在90%以上，发芽势、发芽指数和活力指数也提高了2倍或2倍以上(表2)，说明授粉后20～25 d可能是种子活力形成的关键时期。此后，不同成熟度干燥种子的发芽率基本维持在98%～100%之间，但发芽势和发芽指数以授粉后35 d的干燥种子为最大，分别在93.33%和107.73，而活力指数则以授粉后45 d的干燥种子为最大，为4.01(表2)。

表2 不同成熟度干燥玉米种子活力指标及电导率统计结果Table 2 Statistical results of seed vigor index and electrical conductivity of dried maize with different maturity degree

种子浸泡液的电导率是检测种子活力的有效指标，电导率可以反映种子萌发初期细胞膜重建和损伤修复能力，因此电导率与活力指数呈负相关关系[19]。通过对不同成熟度干燥玉米种子的电导率测定发现，随着收获时间的推移，电导率呈逐渐下降的变化趋势，在授粉后20～45 d间电导率从88 μS/(cm·g)降低至27 μS/(cm·g)，降低了69.3%(表2)，这与前人研究结果吻合，说明越晚收获的种子经干燥后，其细胞完整性越高，破损率越低。

2.4 不同成熟度干燥玉米种子胚内源激素含量

植物的内源激素对种子萌发具有重要影响。测定结果显示，在吸胀12 h 的单个种子胚中，GA3、ABA、CTK和IAA等4 种内源激素含量基本呈现相同的变化规律，均在授粉后35 d 达到最大值，分别达8.93、18.3、15.72 ng和1.14 ng，相比于授粉后20 d的种子胚，分别提高了206%、174%、232%和141%。但此后收获的单个玉米种子的萌动胚中，在授粉后35～45 d间，除GA3含量小幅降低外(6%)，而ABA、CTK和IAA的含量均有大幅度降低，分别降低了48%、39%和46%。

2.5 相关性分析

相关性分析结果显示，不同成熟度干燥种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数等4个种子活力指标均与电导率呈极显著的负相关关系，再次印证电导率可以作为检测种子活力的有效指标。另外，发芽势与种子干重和单个胚的GA3、单个胚的CTK、可溶性总糖含量、可溶性还原糖和总蛋白质含量均显著或极显著相关，发芽率和发芽指数与除总蛋白质含量外的其余5个性状呈显著或极显著相关关系，而活力指数则与除单个胚的CTK含量外的其余5个性状显著或极显著相关(图2)。据此推测，种子中积累的干物质、GA3、可溶性糖、可溶性还原糖等物质均具有促进种子萌发和幼苗形态建成的作用，而积累的蛋白质仅在种子萌发后幼苗建成的过程中发挥促进作用，而CTK仅在种子萌发过程中起正向作用。

表3 不同成熟度干燥种子吸胀12 h后单个种子胚内源激素含量测定结果Table 3 Determination of endogenous hormone content in single embryo after 12 h of imbibition of dried seeds with different maturity degree

注：“*”和“**”分别表示p<0.05和p<0.01。图2 不同成熟度干燥玉米种子活力指标与各个生理性状的相关性Fig.2 Correlation between seed vigor index and physiological characteristics of dried maize with different maturity degree

3 讨论与结论

霜冻会造成玉米种子活力大大降低，因此在确保种子活力的前提下提前采收，有助于减少霜冻对种子活力造成的影响。顾日良等[2]采用不同发芽方法对授粉后35～62 d的京科968杂交种种子活力分析发现，随着收获期的推迟，种子活力不断上升，在授粉后59 d收获的种子活力最高。邢妍妍等[5]研究表明，玉米种子活力形成于脱水阶段，授粉后15 d的种子经过干燥即具有萌发能力，发芽率在5%左右。但不同基因型玉米种子活力的最大值与种子生理状态的关系并无明确关系，一般是杂交玉米种子的活力在生理成熟之前最高，而玉米自交系种子活力多在生理成熟之后达到最大值[20]。在本研究中，玉米自交系JNY 6 F授粉后20 d的种子，经自然干燥后，44%已具备发芽能力，这与前人关于种子活力形成于种子生长发育早期的结论相吻合。另外，发芽势、发芽率和发芽指数以授粉后35 d的种子为最大，此时种子基部出现黑色层，干物质积累也基本停滞，因此基本生理成熟，而活力指数以授粉后45 d的种子为最高，这些研究结果基本与前人研究结果相符。

种子萌发和幼苗生长需要大量的能量和营养。在种子萌发过程中，种子体内贮藏的干物质被降解为小分子物质以维持体内渗透平衡以及提供幼苗形态建成所需的物质和能量[21]。可溶性糖具有保护膜透性的作用[22]，其中单糖(Monosaccharides)和棉子糖(Raffinose)与种子活力密切相关，在加速老化处理后，两种可溶性糖含量显著降低，而种子活力也随之下降[23]。可溶性糖是优先被代谢的糖类，可为种子萌动初期提供能力和代谢产物。因此，可溶性糖含量高的种子会受到更为良好的保护，而且在萌动初期有更为充足的能量来源。本研究发现，JNY 6 F不同成熟度种子经自然干燥后，其体内的可溶性总糖含量以授粉后35 d的种子为最高，而可溶性还原糖积累量在此后仍在缓慢增加，相关性分析结果显示，两类糖的含量均与发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数等4个种子活力指标显著或极显著相关，这与前人研究结果相吻合。蛋白质是有机体的重要组成物质。蛋白质的损伤与修复过程对种子活力和寿命有重要影响[24]。研究发现，籽粒中的蛋白质含量与植株干重极显著正相关，可以作为检测种子活力的有效指标[25]。在本研究中，不同成熟度干燥种子的发芽势和活力指数与体内总蛋白含量显著或极显著相关，而发芽率和发芽指数则与之无明显相关性，说明蛋白质对种子萌发后幼苗的生长起促进作用，即促进幼苗生物量的积累，而与萌发快慢无关，这与前人提出的玉米籽粒中的蛋白质含量与植株干重极显著正相关的结论相印证。

研究表明，ABA的积累会造成种子休眠[10]，而GA3可以打破ABA积累造成的种子休眠[11]。另外，IAA可以通过调控ABA与GA3的合成通路来抑制种子萌发[14-15]，而CTK与GA3相似，与ABA具有拮抗作用，并且可以促进GA3诱导水解酶的产生[12]，从而促进种子萌发。然而，也有报道指出，一些激素在种子萌发过程中存在剂量效应，如低浓度IAA对种子萌发具有促进作用，高浓度IAA具有抑制作用[26-28]；低浓度CTK对种子萌发具有促进作用，高浓度CTK具有抑制作用[29-30]。本研究发现，虽然授粉后35 d收获的种子吸胀12 h后的单个种胚内的ABA、GA3、CTK和IAA含量均达到最大值，但相关性分析结果显示，仅GA3含量与发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数等4项种子活力指标极显著正相关，CTK含量除活力指数外的3个种子活力指标显著正相关，而ABA含量和IAA含量与4个种子活力指标存在正相关关系但未达到显著水平。据此推测，GA3与种子萌发和幼苗生长均有关系，CTK则主要在种子萌发过程中发挥作用，而ABA和IAA在种子萌发和幼苗生长过程中也有一定作用，但这些作用的发挥可能是各种激素间相互作用的结果，并且还可能存在剂量效应，有待进一步研究。