尹明华， 曾淑琴， 曾 荧， 张彩霞， 张慧博， 张丽佳

(1.上饶师范学院生命科学学院， 江西 上饶 334001；2.上饶农业技术创新研究院， 江西 上饶 334001；3.上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室， 江西 上饶 334001；4.上饶市三叶青保育与利用技术创新中心， 江西 上饶 334001)

三叶青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，属葡萄科崖爬藤属植物，为我国特有珍稀药用植物[1]。三叶青具有抗炎、抗病毒、促凋抑瘤、保肝消肿、调节人体双重免疫等作用[2-3]。三叶青一般采用扦插无性繁殖，极易感染烟草花叶病毒[4]。烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)是烟草花叶病毒属病毒的正链RNA病毒类α病毒超群成员，是危害最重的病毒之一，寄主范围广泛[5]。病毒增殖涉及多种宿主因子与病毒基因组编码因子协同作用[6-8]。为了鉴定烟草病毒高效增殖所必需的寄主因子，Ishikawa等[9-10]和Ohshima等[11]已经分离了拟南芥的两个独立突变体烟草病毒增殖蛋白1(tobamovirus multiplication 1，TOM 1)和烟草病毒增殖蛋白2(tobamovirus multiplication 2，TOM 2)。Tsujimoto等[12]证明拟南芥tom 2-1突变体和ttm 1突变体涉及核基因组的重排，影响两个独立的基因TOM 2 A和TOM 2 B，这两个基因都控制烟草病毒增殖表型。TOM 2 A被证明编码一种四通道跨膜蛋白，它与自身和TOM 1整合膜蛋白相互作用。Hagiwara等[13]证明拟南芥TOM 1(AtTOM 1)和TOM 2 A(AtTOM 2 A)是烟草病毒细胞内高效增殖所必需的完整膜蛋白。克隆三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因并对其进行功能分析，对研究烟草病毒增殖蛋白2 A基因在三叶青中的表达和三叶青烟草花叶病毒的增殖具有重要意义。关于烟草病毒增殖蛋白2 A研究的报道较少。利用RT-PCR 技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因，并采用生物信息学方法、烟草转基因技术和实时定量 PCR进行序列、亚细胞定位和组织表达分析，为揭示怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A的生物学功能提供理论依据，为从分子水平调控怀玉山三叶青烟草花叶病毒增殖提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材 料

怀玉山三叶青2个栽培种怀玉1号和怀玉2号试管苗。

1.2 方 法

1.2.1总RNA的提取和cDNA第一链的合成

用Trizol试剂提取怀玉山三叶青怀玉2号试管苗的总RNA，提取步骤按说明书进行，使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和完整性。以提取获得的RNA为模版，按照M-MLV cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA第一链。逆转录引物用Oligo(dT)18 Primer ：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具体步骤按说明书进行。

1.2.2烟草病毒增殖蛋白2 A基因的克隆

利用转录组组装的Unigene序列信息(TRINITY_DN 22922_c0_g 1)，运用 Primer Premier 5.0软件设计引物(F：ATGGCGGCGTGCCGGGGA；R：TCACATTACGATGCAACGGCTCCTT)。PCR扩增条件：95 ℃ 2 min；(95 ℃ 30 s；60.5 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s)(35个循环)；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后， 将含有目的基因的条带与pMD 19-T 载体连接并用热激法转化到感受态细胞E.coliDH 5 α，经鉴定正确的阳性转化子提取质粒送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.3烟草病毒增殖蛋白2 A基因的生物信息学分析

生物信息学分析采用尹明华等[14]的方法。

1.2.4基因克隆和载体构建

以提供的目的基因序列设计引物(去掉终止密码子TAG/TAA/TGA)[CZ-TP 2 A-KpnI -F：GCGGGTCGACGGTACC(此部分为载体同源重组序列)ATGGCGGCGTGCCGGGGWT；CZ-TP 2 A-KpnI -gfpR：TAGACATATGGGTACC(此部分为载体同源重组序列)CATTACGRTGCAACGGCTCC]进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积50 μL)包括17 μL ddH2O、25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix(10 mmol/L each)、2 μL模板DNA、2 μL引物1(10 μmol/L)、2 μL引物2(10 μmol/L)和1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease(1 U/μL)；PCR反应程序为：95 ℃ 30 s；(95 ℃ 15 s，退火温度56 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 1 min)×39个循环；最后延伸72 ℃，5 min。将PCR产物进行凝胶电泳。将条带切胶回收，即为目的基因片段。载体构建采用尹明华等[14]的方法。

1.2.5烟草叶片亚细胞定位

烟草叶片亚细胞定位采用尹明华等[14]的方法。

1.2.6烟草病毒增殖蛋白2 A基因的组织表达分析

分别取怀玉山三叶青2个栽培种怀玉1号和怀玉2号试管苗的根、茎、叶RNA 500 ng，反转录为cDNA。荧光定量 PCR(qRT-PCR，SYBR Green I)检测内参基因为GAPDH。设计引物(R：TTCTCCAAGGGCCACGACC；F：CTGCTCAGGCTGCTCAACTTTT)。qRT-PCR 检测采用20 μL反应体系，PCR反应程序：预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 10 s，退火延伸60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，40个循环。使用 2-△△Ct法计算基因表达水平。实验重复3次。所有数据表示为平均值±标准差，并使用SPSS 19.0软件进行统计分析，应用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验烟草病毒增殖蛋白2 A基因组织表达的差异显著性(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因cDNA序列

通过PCR扩增技术(图1)，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因cDNA总长度为858 bp(图2)，G+C含量为49.53%，A+T含量为50.47%。

2.2 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A氨基酸序列

Protparam预测显示怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A氨基酸序列见图3。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A由285个氨基酸组成，分子量为31 437.53 Da，等电点5.77。带负电残基总数(Asp+Glu)为25，正电荷残基总数(Arg+Lys)为23。序列的N端和C端均为M(Met)。失稳指数(Ⅱ)为39.51，该蛋白质为稳定蛋白质。

图1 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因PCR扩增 Fig.1 PCR amplification of tobamovirus multiplication protein 2 A gene of T. hemsleyanum

2.3 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A亲疏水性分析

从图4可知，高峰值(正值)的区域表示疏水的区域，而负值的“低谷”区域是亲水区域。疏水性结果表明，最大疏水值为3.5左右，在该多肽中说明该处的疏水性最强；亲水峰最大值为-2.5左右，整个蛋白质表现出高度的亲水性，说明该蛋白为亲水性蛋白质。

2.4 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A二级结构分析

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A的二级结构预测如下：GOR 预测显示其二级结构由α-螺旋 (Alphahelix Hh，28.77)、β - 片层(Extendedstrand Ee，16.14)、无规则卷曲(Randomcoil Cc，55.09)构成(图5)。从分布位点上来看，C端和N端含无规则卷曲、β-片层和α-螺旋，且无规则卷曲、β-片层和α-螺旋散布于整个蛋白质中。

2.5 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A三级结构分析

SWISS-MODEL预测显示，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A的三级结构为单体(图6)。

图2 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因碱基组成Fig.2 Base composition of tobamovirus multiplication protein 2 A gene of T. hemsleyanum

图3 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A氨基酸序列 Fig.3 Amino acid sequence of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

图4 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A亲疏水值分布Fig.4 Distribution of hydrophilic and hydrophobic water values of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

注：蓝色代表 α-螺旋；红色代表β -片层；紫色代表不规则卷曲。 图5 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A二级结构各部分的比例 Fig.5 Proportion of the secondary structure of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

图6 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A三级结构Fig.6 The tertiary structure of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

2.6 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A亚细胞定位预测

采用WoLFPsort在线软件对怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因的表达部位进行预测，结果为：定位于细胞核中的数量为6，线粒体中的数量为6，叶绿体中的数量为1，细胞质中的数量为1。表明怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因主要存在细胞核、线粒体、叶绿体和细胞质中。

2.7 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A系统进化分析

从构建的进化树(图7)中可见，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A在进化上与硬粒小麦、节节麦、乌拉尔图小麦、大麦、二穗短柄草的亲缘关系较近，尤其是与硬粒小麦未命名蛋白产物在进化上具有最高的亲缘关系。

图7 怀玉山叶青烟草病毒培殖蛋白2 A系统进化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

2.8 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A同源蛋白的序列比对信息

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A同源蛋白的序列比对信息见图8。

图8 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因氨基酸序列的同源性比较Fig.8 Homology comparison of amino acid sequences of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

图9 烟草病毒增殖蛋白2 A基因菌落PCR电泳图 Fig.9 Colony PCR electrophoresis of tobacco virus proliferating protein 2 A gene

2.9 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因瞬时表达载体构建

挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒，对重组质粒进行酶切检测，扩增产物测序比对结果显示，目的基因已插入载体，表达载体构建准确(图9)。

2.10 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A亚细胞定位分析

利用激光共聚焦显微镜观察，融合GFP的烟草病毒增殖蛋白2 A转化烟草叶片只在细胞质和细胞核观察到绿色荧光(图10)，表明烟草病毒增殖蛋白2 A定位于细胞质和细胞核，与WoLFPsort在线软件预测结果基本一致。

图10 TP 2 A-GFP基因亚细胞定位Fig.10 Subcellular localization of TP 2 A-GFP gene

2.11 怀玉山三叶青2个栽培种不同器官中烟草病毒增殖蛋白2 A基因的表达分析

从图11可知，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因在根、茎、叶中均有表达，但在不同组织器官的表达情况差异显著(图11)，怀玉2号和怀玉1号均在叶中表达量最高。

3 讨 论

Hagiwara等[13]证明拟南芥TOM 1(AtTOM 1)和TOM 2 A(AtTOM 2 A)是烟草病毒细胞内高效增殖所必需的完整膜蛋白。AtTOM 1与烟草病毒编码复制蛋白的螺旋酶结构域多肽和AtTOM 2 A相互作用，AtTOM 1和AtTOM 2 A都是烟草病毒复制复合物的组成部分。tobamoviral RNA复制复合物的形成发生在含TOM 1的膜上，并由TOM 2 A促进。Tsujimoto等[12]证明拟南芥TOM 2 A(AtTOM 2 A)的ORF编码一个280氨基酸的多肽序列，并推导TOM 2 A的氨基酸序列包含几个疏水区域，SOSUI软件预测为四通道跨膜蛋白。NCBI BLAST比对的结果表明，拟南芥TOM 2 A和TOM 2 B与任何已知功能的基因都没有显著的同源性。在本试验中，从碱基组成和G+C含量基本平衡来看，G+C的含量越高，基因稳定性越高，三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因基本处于稳定状态，这可能为三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因稳定遗传与进化提供了保证。从同源性来看，三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因TOM 1与硬粒小麦、节节麦、乌拉尔图小麦、大麦、二穗短柄草的同源性较高，说明三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因具有保守性。这些保守区段的发现将为其他物种新的三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因的克隆提供序列依据。本试验通过软件预测怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A主要存在细胞核、线粒体、叶绿体和细胞质中；而通过烟草叶片亚细胞定位分析表明，烟草病毒增殖蛋白2 A定位于细胞质和细胞核中。两者结果基本一致。本试验中，实时定量PCR结果显示，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因在根、茎、叶中均有表达，但在不同组织器官的表达情况差异显著，其中怀玉2号和怀玉1号在叶中表达量最高。表明怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因主要的表达位置在叶片。本研究首次从怀玉山三叶青基因组中克隆出烟草病毒增殖蛋白2 A基因，并对克隆的基因序列和其氨基酸序列进行了生物信息学、亚细胞定位和组织表达分析，为三叶青烟草花叶病毒增殖的研究补充了基础资料。

注：每个品种内小写字母表示0.05水平上的差异性。图11 怀玉山三叶青2个栽培种不同器官中烟草病毒增殖蛋白2 A基因相对表达量分析Fig.11 Relative expression analysis of tobamovirus multiplication protein 2 A in different organs of two cultivars of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan