续 言， 王景芸， 吴宜静， 张一鸣， 朱梓宁， 蔡 明， 潘会堂， 张启翔

(北京林业大学园林学院， 北京 100083)

紫薇(Lagerstroemiaindica)是千屈菜科紫薇属的重要木本花卉，为我国原产树种，有较为悠久的栽培历史，自唐代就被作为观赏花木栽培。紫薇属植物在夏季少花季节开花，花色丰富、花期长达3个多月，是良好的园林绿化树种[1]。花香是园林植物重要的观赏性状之一，但有色少香是紫薇观赏性状的一个缺憾。尾叶紫薇(L.caudata)是紫薇属中具有明显花香的品种，常被用作香花育种的重要亲本。但尾叶紫薇为小乔木，花色单一，花径小，且尾叶紫薇与其他紫薇品种的杂交后代香味减弱。因此，仍需通过多种育种手段选育综合性状优良的香花紫薇新品种。

化学诱变育种是利用化学药剂改变植物的遗传物质，并将优良的突变材料培育成为新品种的育种方法[2]。甲基黄酸乙酯(EMS)诱变剂是化学诱变剂中烷化剂的典型代表，具有高效低毒，可诱导高密度的系列等位基因点突变的特点，被公认为世界上最有效和广泛使用的化学诱变剂之一。利用EMS诱变技术已经成功构建了非洲菊[3]、菊苣[4]、观赏辣椒[5]、长春花[6]、春兰[7]、大花萱草[8]、旱柳[9]、木槿[10]等观赏植物的突变体库。

紫薇EMS诱变开始于美国，1998年Whitcomb利用EMS技术诱导，获得了颜色鲜红、复色花及可持续开花等8个各具特色的优良紫薇品种[11]。国内对紫薇的EMS诱变育种研究开始较晚，伍汉斌等[12]以南紫薇种子为材料，用不同浓度EMS溶液对南紫薇种子进行处理，研究了EMS处理对紫薇种子萌发和幼苗生长的影响，得到EMS诱变紫薇种子的半致死浓度为3%处理6 h。

本研究用EMS对尾叶紫薇的成熟种子进行处理，研究在不同处理浓度和时间下EMS对尾叶紫薇种子萌发和幼苗生长的影响，筛选EMS诱变尾叶紫薇的最佳条件，为香花紫薇优良品种的选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验材料为尾叶紫薇成熟种子，2020年8月采摘于北京市昌平区国家花卉工程中心小汤山基地。EMS诱变剂采购自SIGMA公司。

1.2 方 法

将尾叶紫薇的成熟种子用蒸馏水浸泡一夜进行预处理。以不含诱变剂的蒸馏水为对照组，设置浓度梯度分别为0.5%、1%、2%、4%的EMS溶液，处理时间分别为4 h、8 h、12 h。使用大而饱满的尾叶紫薇成熟种子进行实验处理，每个重复50粒种子，3组重复，共45个处理。将处理后的种子用5%的硫代硫酸溶液冲洗30 min后再用蒸馏水冲洗2 h，将清洗后的种子均匀播于垫有湿润试纸的培养皿中，在25 ℃培养箱中进行培养。再次重复上述处理，将清洗后的种子点播在国家花卉工程中心小汤山基地温室内，进行正常的养护管理。

1.3 指标测定

1.3.1种子萌发的测定

定时观察播种后的萌发情况，以种子露白作为萌发标准，每天按时统计各处理的发芽数，连续3 d发芽数不再变化时视为发芽结束。测定种子的发芽势，统计发芽率。计算公式如下：

发芽势(%)=(处理后9 d内正常发芽的种子数/种子总数)×100%；

发芽率(%)=(处理后14 d内正常发芽种子数/种子总数)×100%。

1.3.2根长测定

将诱变后的尾叶紫薇种子培养至10 d，使用游标卡尺测量尾叶紫薇根长，每个重复随机选择10株测量，重复3次，取根长的平均值。

1.3.3EMS诱变半致死剂量的确定

相对发芽率(%)=(处理组的发芽率/对照组的发芽率)×100%；

相对发芽势(%)=(处理组的发芽势/对照组的发芽势)×100%。

半致死剂量(Lethal concentration 50，LC50)以EMS处理尾叶紫薇种子的相对致死率确定，相对致死率为50%时获得半致死剂量。

1.3.4紫薇幼苗形态学指标的观测

待幼苗正常生长120 d后统计植株的分枝数、叶片数、茎粗、株高、冠幅，选取3片成熟叶片测量叶长、叶宽并计算叶面积，叶形指数用“叶片长/叶片宽”表示，成熟叶片面积使用Adobe Photoshop CC 2019软件处理后获得。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析，数据用平均数加减标准差表示。采用matlab 2018软件对得到的数据进行分析，通过数学建模获得尾叶紫薇EMS诱变处理的理论半致死剂量。

2 结果与分析

2.1 不同处理对尾叶种子萌发的影响

将尾叶紫薇种子播种在培养皿6 d后，对照组的种子最先开始萌发(最早出苗的是蒸馏水处理4 h和蒸馏水处理12 h)；第7天起，0.5%和1%处理4 h、处理8 h组和0.5%处理12 h组开始萌发，第8天除4%处理组外其余处理组均开始萌发。随着EMS浓度升高和处理时间延长，萌发时间推迟越长，到第9天，萌发起始完全结束；直至第14天，各处理组萌发数基本确定。结果表明，EMS处理能够抑制尾叶紫薇种子的萌发，且EMS的浓度越高，处理时间越长，抑制作用越明显。与对照组相比，诱变组尾叶紫薇种子的发芽势和发芽率随EMS浓度的升高都呈逐渐下降的趋势，且EMS浓度越高，萌发数值越低，与对照组差异极显著。

注：不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。下同。图1 各处理组种子的发芽率和发芽势Fig.1 Germination rate and germination potential of seeds in each treatment group

由图1可知，不同浓度的EMS诱变剂对尾叶紫薇种子浸泡4 h后的发芽率、相对发芽率、发芽势和相对发芽势都有显著影响，且表现出一定的规律。与对照组相比，发芽率、相对发芽率均随EMS浓度的升高而降低，且浓度越高，发芽率下降越快。低浓度的EMS溶液处理对种子萌发的抑制作用不明显，0.5%处理的相对发芽率达80%以上，且与对照组的差异不显著；高浓度的EMS溶液处理抑制作用明显，2%～4%梯度下，相对发芽率下降了32.73%，下降速率最快。且随着浓度的升高，发芽势也呈降低趋势，发芽势的变化规律与发芽率基本相同。与4 h处理的变化规律相同，8 h、12 h的EMS溶液处理对尾叶紫薇种子的萌发具有抑制作用，经过长时间的EMS处理后，不同组别间的差异极显著(p<0.01)。且随着浓度的升高和处理时间的延长，抑制作用逐渐增强。在4%浓度下处理8 h、12 h种子全部致死。

2.2 不同EMS处理对尾叶紫薇根长的影响

观察发现，EMS处理对尾叶紫薇根的形态造成了影响。相同处理浓度下，处理时间越长，根长越短，EMS处理浓度与根长关系也呈相同的变化规律。从图2可知，不同处理时间对尾叶紫薇种子幼苗根长影响达极显著(p<0.01)，不同处理浓度对尾叶紫薇根长也存在极显著影响，处理浓度和处理时间相互作用时，根长变化也呈显著差异。

图2 各处理组根长Fig.2 Root length of each treatment group

2.3 尾叶紫薇EMS处理半致死剂量的初步选择

由表1可知，EMS处理抑制了尾叶紫薇的萌发，处理时间越长，浓度越高，相对致死率越高。低浓度处理4 h对尾叶紫薇种子的萌发效应不显著，0.5%处理4 h后相对致死率与对照组没有显著差异，但4%处理后相对致死率显著增加，达到80.91%。方差分析结果显示，随着处理时间的增加，各组别之间差异极显著(p<0.01)，说明不同的处理浓度和处理时间对尾叶紫薇种子萌发的相对致死率有极显著影响。半致死剂量通常作为有效诱发植物产生突变的适宜诱变剂量。本实验表明，2%浓度处理4 h的相对致死率为48.18%，1%浓度处理12 h的相对致死率为58.25%，以上2种处理最接近半致死剂量，经过比较初步确定EMS处理尾叶紫薇的半致死剂量为2%处理4 h。

表1 不同处理对尾叶紫薇萌发相对致死率的影响Table 1 Effects of different treatments on the germination relative lethal rate of Lagerstroemia caudata

2.4 尾叶紫薇EMS处理理论半致死剂量的选择

相对致死率的变化受处理浓度和处理时间的影响，但本实验数据较为分散，无法准确估计半致死剂量。插值函数被广泛应用于数据分析中，指在离散数据的基础上补插连续函数，使得这条连续曲线通过全部的离散数据点[13]。采用“双线性插值”的方法对实异极显著(p<0.01)。下同。

验数据进行处理，既可以保证插值结果在实验数据点上的误差为零，又可以保证插值结果符合之前定性分析中得出的相对致死率随处理浓度和处理时间的变化趋势。本次试验利用matlab软件自带的插值函数interp 2在matlab软件内编程实现。最终通过线性插值的方法得到如图3所示的模型，揭示了处理时间、处理浓度和相对致死率的变化规律，可以快速获得大量实验数据。将相对致死率(z)=50%代入模型中，可以得到处理浓度和处理时间的具体值。本实验中，当处理浓度为0.78%、处理时间为12 h时，取得EMS最低浓度下诱导尾叶紫薇的半致死剂量；当处理浓度为2.11%、处理时间为4 h时，取得最短处理时间下的诱导尾叶紫薇的半致死剂量。

图3 使用matlab得到的不同处理组尾叶紫薇半致死率的函数Fig.3 The function of half-lethal rate of Lagerstroemia caudata in different treatment groups obtained using matlab

2.5 不同浓度处理对尾叶紫薇幼苗生长的影响

不同浓度EMS溶液处理4 h后，正常养护管理生长120 d的植株进行形态学测量，结果见表2。由表2可知，经过不同浓度的EMS处理后，尾叶紫薇幼苗的生长受到了一定的影响，4%处理下，尾叶紫薇的分枝数明显多于其他处理组，与其他处理组的差异极显著，说明高浓度的EMS处理可促进尾叶紫薇分枝。随着EMS处理浓度的增加，尾叶紫薇幼苗的株高呈先升后降的趋势，2%处理组的株高最高，达48.79 cm。茎粗和冠幅对EMS处理的响应不明显，各处理组间没有表现出明显的变化规律。同时，由表3可知，4%处理组的叶片数、叶形指数、叶面积都大于其他处理组，表现为促进作用，且与其他处理组的差异极显著。但是在低浓度的EMS处理后，叶形指数在2.0～2.2之间，叶面积在11～13 cm2之间波动，处理组的叶片形态与对照组没有明显的差异。

表2 不同浓度处理对尾叶紫薇幼苗生长的影响Table 2 Effects of different concentrations on the growth of Lagerstroemia caudata seedlings

表3 不同浓度处理对尾叶紫薇幼苗叶片的影响Table 3 Effects of different concentration treatments on the leaves of Lagerstroemia caudata seedlings

3 结论与讨论

EMS诱变简单高效，对植物染色体的损伤较小，被用于植物体各个部位组织、器官的诱变。吸胀后的种子吸收诱变剂的速率非常高，能够使更多的诱变剂以更快的速度进入胚组织，成为实验中最常见的诱变材料之一[14-15]。

不同处理浓度和处理时间对尾叶紫薇种子的发芽时间、发芽率、发芽势以及幼苗根的生长都有显著的影响。处理浓度和处理时间是决定EMS诱变的关键因素，且经EMS溶液处理后，尾叶紫薇种子的发芽起始时间和发芽进程都出现了一定程度的延缓，说明EMS处理能够抑制种子的萌发。幼苗对水分和养分的吸收情况与根的长度有关，根的长度过于短小不利于幼苗吸收营养，高浓度EMS诱变下尾叶紫薇幼苗成活率较低可能与此有关。有研究证明，低浓度的EMS处理可以促进部分植物种类的种子萌发，如醉鱼草[16]、知母[17]、无芒雀[18]等，这可能与不同物种种皮的透水性、种子的大小和内部结构以及种子的休眠机制有关。

在本次试验中，2%浓度处理4 h尾叶紫薇成熟种子的相对致死率为48.18%，1%浓度处理12 h的相对致死率为58.25%，以上2种处理最接近半致死浓度。在进行诱变实验时可以选择2%处理4 h作为处理方式。本试验采用“双线性插值”的方法对实验数据进行处理，通过数学分析得出，当处理浓度为0.78%、处理时间为12 h时，取得EMS最低浓度下诱导尾叶紫薇的半致死剂量；当处理浓度为2.11%、处理时间为4 h时取得最短处理时间下的诱导尾叶紫薇的半致死剂量。

当前紫薇属植物的EMS诱变研究较少，伍汉斌等[12]在对南紫薇种子进行EMS诱变试验时得出，3.0%EMS浓度处理6 h为诱变南紫薇种子的半致死剂量，本实验的结果与之有较大差异，可能是尾叶紫薇与南紫薇的种间差异性。在其他木本观赏植物中，慎家辉等[19]探索了EMS对杜梨的诱变效应，得到0.3%处理24 h为杜梨诱变的最佳剂量，Dhakshanamoorthy等[20]得到EMS诱变麻风树的半致死剂量为3%处理8 h；孙慧[21]根据萌发率和成苗率确定海滨木槿种子的适宜诱变浓度为1.5%，诱变处理时间4 h；朱翠翠等[22]对青檀种子的研究发现，1.2%～1.5%EMS浓度处理48 h为青檀种子的半致死剂量。这说明不同植物对EMS处理的敏感性不同，诱变效果存在很大差异。

研究发现，浸种时间越长，尾叶紫薇的萌发率越高。对照组处理12 h，发芽率、发芽势明显高于4 h处理组。在预实验中发现，EMS诱变处理尾叶紫薇种子时，较高的环境温度可以提高萌发率。结果表明，在一定温度范围内，温度升高有利于突变频率提高。可作为今后实验的探索依据。

EMS处理对尾叶紫薇后期的生长产生了一定的影响。高浓度的EMS处理可以促进尾叶紫薇分枝和叶片增大，较低浓度的EMS处理可以促进株高增长。在冠幅、茎粗等方面，EMS处理的效应不明显。但诱变效应具有很大的随机性，处理组间个体差异性较大，具体变化规律仍需加大实验量再次进行统计。

本实验设置了不同的浓度梯度，在3个不同处理时间下使用EMS溶液对尾叶紫薇进行浸种，通过对各处理组发芽率、发芽势、相对发芽率、相对发芽势以及幼苗根的长度、苗期生长状况等指标进行研究分析，最终获得了尾叶紫薇种子各种指标在EMS处理条件下的变化规律，使用统计软件进行分析获得了处理时间和处理浓度的相互作用关系。通过对半致死剂量的初步估计，确定了尾叶紫薇EMS诱变的适宜剂量为2%浓度处理4 h。同时使用matlab软件建造模型预测了EMS诱变尾叶紫薇种子的理论半致死组合，对播种后的幼苗进行了初步的形态学分析统计。试验结果可为尾叶紫薇的诱变体库建立及诱变育种提供参考。