陈慧泽，孟胜喜，霍清萍，王 兵，李文涛，潘卫东，张云云

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种进行性神经退行性疾病，影响多巴胺能神经传递，导致运动迟缓、强直和静止性震颤[1-2]。2016年全球PD患病人数为606.3万人[3]，2017年患病人数增至853.0万人[4-5]。在我国60岁以上人群中，PD发病率为1%～2%[6]。PD病程进展过程中病人均有不同程度的运动功能异常或障碍，且伴随其他非运动障碍系统症状，在后者中通常以睡眠障碍(sleep disorders)为主。PD病人合并睡眠障碍症状的非运动障碍病症在PD长期病程发展中，执行功能受损尤为常见，这是认知功能损害的主要症状[7]。中医药因其多层次、多靶点、多途径且副作用小等作用特点和优势在PD的防治中越来越受到国内外学者的关注和重视。中药复方恒清Ⅳ号方是本课题组通过长期临床观察总结出的防治PD疗效确切的中药复方。本实验旨在探讨中药复方恒清Ⅳ号方对PD模型大鼠睡眠障碍的作用及其机制，为中药复方恒清Ⅳ号方防治PD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 无特定病原体(SPF)级雄性Wistar大鼠60只，体质量170～200 g，购于上海灵畅生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK (沪)2018-003，大鼠饲养于上海吉凯基因化学技术有限公司动物房，自由饮水和进食，温度(22±2)℃，相对湿度为(60±5)%，自动光/暗控制(每12 h交替)。

6-羟基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA，lot：H122，Sigma-Aldrich公司，美国)、阿扑吗啡(apomorphine，lot：M5432，Sigma-Aldrich公司，美国)，抗坏血酸(lot：54-82-3，上海时代生物技术有限公司)，脑立体定位仪(深圳瑞沃德公司)，脑电信号采集分析系统(成都泰盟公司)，高效液相色谱仪(岛津公司，日本)，振动切片机(莱卡公司，德国)。

恒清Ⅳ号方组成：熟地黄20 g，淫羊藿20 g，黄芪15 g，肉苁蓉10 g，龟板15 g，地龙10 g，天麻15 g，丹参10 g，川芎10 g，当归10 g，白芍10 g。由上海市第六人民医院中药房提供。按处方比例称取以上药材，加10倍量水浸泡0.5 h，随后煎煮3次，每次40 min，过滤，合并以上3次滤液，37 ℃水浴加热浓缩，根据临床实际用药情况对药液进行浓缩处理，并以中质量浓度匹配临床的实际用药浓度。中质量浓度浓缩至0.535 g/mL，置4 ℃冰箱贮存备用。

1.2 PD模型大鼠的制备和动物分组 采用10%水合氯醛对Wistar大鼠进行腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪上。首先，剥离大鼠的脑膜，以大鼠立体定位图谱为参照确定前脑内侧束坐标，然后用微量注射器注射4 μL浓度为4 g/L的6-OHDA(0.02%抗坏血酸的生理盐水溶液作为溶剂)。待大鼠清醒后腹腔注射青霉素，连续腹腔注射3 d。造模4 周后，腹腔注射1.0 mg/kg的阿扑吗啡诱发旋转实验。PD模型大鼠造模成功的判定标准：3次诱导旋转圈数均为30 min>210 r。

将40只造模成功的大鼠按照随机数字表法分为模型组、恒清Ⅳ号方低剂量(low dose，LD)组、恒清Ⅳ号方中剂量(middle dose，MD)组和恒清Ⅳ号方高剂量(high dose，HD)组，每组10只。另取10只未造模的正常大鼠作为正常组。LD组、MD组和HD 组大鼠每日以相应剂量的恒清Ⅳ号方溶液灌胃。依据人和动物体表面积折算系数换算[8]，LD组、MD组及HD组分别为10 mg/kg、20 mg/kg及40 mg/kg，以磷酸缓冲盐溶液(PBS)配制，共灌胃4 周。正常组及模型组大鼠均以等量生理盐水灌胃，共灌胃4 周。

1.3 各组大鼠睡眠时间检测 将大鼠固定于脑立体定位仪上。把3个脑电电极全部植入颅骨内，把2个肌电电极分别植入两侧颈部深肌层。1周后记录大鼠的脑电图(EEG)及肌电图(EMG)[9-10]。各组均记录72 h时大鼠的EEG和EMG，并以10 s为一个时间段分析及鉴别，记录每组大鼠总睡眠时间(total sleep time，TST)、觉醒时间(awaken time，AT)、快波睡眠时间(fast wave sleep time，FWST)和慢波睡眠时间(slow wave sleep time，SWST)。

1.4 高效液相色谱法(HPLC)分析各组大鼠纹状体中多巴胺(DA)及5-羟色胺(5-HT)含量 大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，断头后取脑，放入人工脑脊液中，从大鼠脑片中分离出纹状体的组织样品，将1 mg以上样品加入0.04 mol/L高氯酸100 μL，进行超声粉碎30 s，然后以4 ℃、14 000 r/min离心30 min，取上清液，分别取20 μL进行HPLC，采用Breeze 2软件计算单位体积样品中DA及5-HT含量。

2 结 果

2.1 各组大鼠TST、AT、FWST和SWST比较 与正常组比较，模型组大鼠TST明显缩短，AT明显延长，SWST及FWST明显缩短(P<0.05)；与模型组比较，LD 组、MD组和HD组大鼠TST延长，AT缩短，SWST、FWST延长(P<0.05)；与LD组比较，MD组、HD组大鼠TST延长，AT缩短，SWST、FWST延长(P<0.05)。与MD组比较，HD组大鼠TST延长，AT缩短，SWST、FWST延长(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠TST、AT、FWST和SWST比较(±s) 单位：min

2.2 各组大鼠纹状体中DA、5-HT水平比较 与正常组比较，模型组大鼠纹状体DA、5-HT水平均明显降低(P<0.05)；与模型组比较，LD组、MD组和HD组大鼠纹状体DA、5-HT水平均升高(P<0.05)；与LD组比较，MD组、HD组大鼠纹状体DA、5-HT水平均升高(P<0.05)；与MD组比较，HD组大鼠纹状体DA、5-HT水平均升高(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠纹状体中DA、5-HT水平比较(±s) 单位：ng/mg

3 讨 论

PD是一种进行性加重的神经退行性疾病，以进行性运动和非运动功能障碍为主要特征，是第二大神经系统退行性疾病。目前尚缺乏有效根治手段。PD在中医学中属于“颤证”的范畴。中医药在防治PD方面发挥着越来越重要的作用。

5-HT和DA是在机体睡眠-觉醒过程中发挥重要作用的神经递质[11-12]。5-HT为抑制性神经递质，可调节睡眠-觉醒周期，促进慢波睡眠产生并缩短入眠期和浅睡期，起到镇静催眠的作用[13]。DA是单胺类神经递质，PD病人DA的减少直接影响生物钟的基因环路，引起昼夜节律紊乱[14-16]。

恒清Ⅳ号方是本课题组基于中医基础理论，通过长期临床观察总结出的防治PD疗效确切的中药复方，其组成如下：熟地黄20 g，淫羊藿20 g，黄芪15 g，肉苁蓉10 g，龟板15 g，地龙10 g，天麻15 g，丹参10 g，川芎10 g，当归10 g，白芍10 g。全方共奏补益肝肾、滋阴补血、活血祛瘀之功。

现代药理研究已经证实，熟地黄可能通过升高抑制性氨基酸相关基因的表达而缓解左旋多巴诱导异动症的症状[17]；熟地黄的主要成分熟地黄多糖能够抑制小鼠的自发活动，缩短阈下剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期，延长睡眠时间[18]。黄芪的主要成分黄芪甲苷可增加PD小鼠自发活动次数，且呈一定的剂量依赖性[19]。肉苁蓉可以改善PD模型大鼠的行为障碍，其对多巴胺神经细胞的保护作用可能是通过影响磷脂酸肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路，上调Bcl-2表达，下调Bax表达，升高Bcl-2/Bax值，进而抑制神经细胞的凋亡实现的[20]。龟甲水煎液对PD模型大鼠有治疗作用，能减轻黑质路易小体的表达，减少脑组织内原有多巴胺神经元的缺失，量效关系明显[21]。地龙的乙酸乙酯、氯仿和水提部位是其镇静、催眠、抗惊厥作用的主要活性部位[22]。川芎的主要成分川芎嗪(ligustrazine)可以明显改善1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)诱导的大鼠运动障碍并可显著防止MPTP诱导的多巴胺能神经元损伤[23]。丹参可以改善脑微循环，提高血流中氧的含量，促使受伤的脑细胞得以修复，纠正紊乱的大脑功能，保护脑神经的正常传递和传导，解除病人由于失眠而产生的各种不良症状如头痛、焦虑等，使病人能进入正常的睡眠[24]。当归挥发油可有效改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能缺损，降低脑梗死体积比、脑血管通透性和脑含水量，降低血清一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)含量，增强超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。提示当归挥发油对脑缺血再灌注损伤有显著保护作用，其作用机制可能与提高脑组织抗氧化能力有关[25]。芍药的主要成分芍药苷可明显延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间，具有明显的催眠作用[26]。

本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠TST明显缩短，AT明显延长，SWST及FWST明显缩短(P<0.05)；与模型组比较，LD组、MD组和HD 组大鼠TST延长，AT缩短，SWST、FWST延长(P<0.05)；与LD组比较，MD 组、HD组大鼠TST延长，AT缩短，SWST、FWST延长(P<0.05)；与MD组比较，HD组大鼠TST延长，AT缩短，SWST、FWST延长(P<0.05)。表明恒清Ⅳ号方可有效改善PD模型大鼠的睡眠障碍，增加TST，减少AT，且恒清Ⅳ号方的疗效与剂量呈正相关。与正常组比较，模型组大鼠纹状体DA、5-HT水平均明显降低(P<0.05)；与模型组比较，LD组、MD组和HD组大鼠纹状体DA、5-HT水平升高(P<0.05)；与LD 组比较，MD组、HD组大鼠纹状体DA、5-HT水平升高(P<0.05)；与MD组比较，HD组大鼠纹状体DA、5-HT水平升高(P<0.05)。表明PD大鼠模型的纹状体DA、5-HT水平均与恒清Ⅳ号方的剂量呈正相关。

因此，恒清Ⅳ号方可以改善PD大鼠模型的睡眠障碍，且量效关系呈正相关，其可能通过提高纹状体中DA、5-HT含量而发挥作用。