李 朋，徐建辉，胡 威

心血管疾病是全球死亡相关的主要病因，严重危害人们的健康，心肌缺血/再灌注损伤被认为是心血管疾病的重要危险因素，近年来，研究表明中医药治疗心血管疾病疗效确切，安全性高[1]。苦荞即苦荞麦，是一种重要的药食两用植物，其主要活性成分苦荞黄酮具有降血糖、降血脂、抗氧化、清除氧自由基等作用，可开发用于防治心脑血管疾病[2]。研究报道苦荞麦黄酮可能通过提高氧自由基清除能力，抑制氧自由基产生，降低脂质过氧化损伤，对大鼠缺血再灌注心肌具有一定的保护作用[3]。复方苦荞麦制剂可能通过抑制心肌脂质过氧化反应对大鼠糖尿病心肌损伤具有保护作用[4]。苦荞麦总黄酮对软脂酸损伤的脐静脉内皮细胞具有明显的保护作用[5]。以上研究表明苦荞黄酮对心肌损伤具有保护作用，但其作用机制尚不清楚。研究表明LncRNA和miRNA在心肌缺血再灌注损伤的发生和发展中起着至关重要的作用，与细胞凋亡以及氧化应激、炎症和线粒体功能障碍有关[6]。研究报道上调JHDM1D反义RNA1(JHDM1D-AS1)通过靶向miR-101-3p-DUSP1减轻臂丛神经损伤后的脊髓中神经炎症和神经元损伤[7]。然而JHDM1D-AS1对心肌损伤的影响尚不清楚。本实验旨在研究苦荞黄酮是否通过调控JHDM1D-AS1影响心肌损伤。

1 材料与方法

1.1 材料 心肌细胞H9c2购自美国ATCC；DMEM培养基购自武汉益普生物科技有限公司；苦荞黄酮购自南京景竹生物科技有限公司；凋亡检测试剂盒购自艾美捷科技有限公司；蛋白提取试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量检测试剂盒购自北京麦瑞博生物科技有限公司；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 细胞处理与分组 心肌细胞H9c2用DMEM培养基培养，取对数生长期细胞，将其接种至预先用95%N2+5%CO2饱和过的无血清无糖的DMEM培养基，并将其置于95%N2+5%CO2培养箱中培养4 h模拟缺氧，然后换成含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在正常CO2培养箱内培养4 h模拟复氧，作为缺氧/复氧(H/R)组；正常培养的细胞作为Con组。将H9c2按上述方法缺氧4 h后，换成含 50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L苦荞黄酮的DMEM高糖培养基培养4 h，作为H/R+苦荞黄酮低、中、高剂量组；将pcDNA、pcDNA-JHDM1D-AS1转染至H9c2中，然后进行缺氧/复氧，记为H/R+pcDNA组、H/R+pcDNA-JHDM1D-AS1组；将si-NC、si-JHDM1D-AS1转染至H9c2中，然后进行缺氧/复氧，再用200 μg/L苦荞黄酮处理，记为H/R+苦荞黄酮+si-NC组、H/R+苦荞黄酮+si-JHDM1D-AS1组。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，消化、离心、洗涤后置于流式管中，加入300 μL结合液重悬细胞，然后加入异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白(Annexin Ⅴ-FITC)染液和碘化丙啶(PI)染液各5 μL，避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.4 蛋白质印迹(Western Blot)法检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，配胶，取出蛋白样品进行10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后将蛋白通过90 V恒压90 min转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，取出膜后加5%脱脂奶粉封闭1 h，加入特异性Bcl-2相关X蛋白(Bax)、淋巴瘤B细胞-2(Bcl-2)一抗4 ℃孵育过夜；加入二抗室温反应2 h，加入电化学发光试剂(ECL)显色，曝光，分析蛋白条带的灰度值，计算蛋白相对表达水平。

1.5 试剂盒检测SOD活性和MDA水平 收集各组细胞，按照SOD及MDA试剂盒说明书的步骤要求进行操作，分别于对应波长处测定各组细胞的光密度(OD)值，按各说明书的公式测定各组SOD活性和MDA水平。

1.6 qRT-PCR检测JHDM1D-AS1和miR-421的表达水平 提取细胞总RNA，合成cDNA后，按试剂盒说明书进行PCR，相对表达量用2-△△Ct法计算。以GAPDH和U6为内参，JHDM1D-AS1正向引物序列：5′-CCTCGCGACGCTGAGAGAATC-3′，反向引物序列：5′-ACGGCACATTCCTCCCTCGGA-3′；GAPDH正向引物序列：5′-GATACACGGAGCACCAGGTT-3′，反向引物序列：5′-CAGGTCACATACACGGTTGC-3′；miR-421正向引物序列：5′-CTCACTCACATCAACAGACATTAATT-3′，反向引物序列：5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′；U6正向引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，反向引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.7 双荧光素酶报告实验 构建JHDM1D-AS1的野生型和突变型荧光素酶载体，然后分别与miR-NC和miR-421通过脂质体法共转染至心肌细胞，按照说明书检测荧光素酶活性。

2 结 果

2.1 苦荞黄酮对H/R心肌细胞损伤及氧化应激的影响 与Con组比较，H/R组心肌细胞凋亡率升高，Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低，SOD活性降低，MDA水平升高(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+苦荞黄酮低剂量组、H/R+苦荞黄酮中剂量组、H/R+苦荞黄酮高剂量组心肌细胞凋亡率降低，Bax表达水平降低，Bcl-2表达水平升高，SOD活性升高，MDA水平降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)。详见图1、表1。

与Con组比较，＊ P<0.05；与H/R组比较，# P<0.05；与H/R+苦荞黄酮低剂量组比较，△ P<0.05；与H/R+苦荞黄酮中剂量组比较，& P<0.05。

表1 各组心肌细胞凋亡率及SOD活性、MDA水平比较(±s，n=3)

2.2 苦荞黄酮对H/R心肌细胞中JHDM1D-AS1和miR-421表达的影响 与Con组比较，H/R组心肌细胞中JHDM1D-AS1表达水平降低，miR-421表达水平升高(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+苦荞黄酮低剂量组、H/R+苦荞黄酮中剂量组、H/R+苦荞黄酮高剂量组心肌细胞中 JHDM1D-AS1升高，miR-421表达水平降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)。详见表2。

表2 各组JHDM1D-AS1和miR-421表达比较(±s，n=3)

2.3 JHDM1D-AS1对H/R心肌细胞损伤及氧化应激的影响 与H/R组和H/R+pcDNA组比较，H/R+pcDNA-JHDM1D-AS1组JHDM1D-AS1表达水平升高，miR-421表达水平降低，心肌细胞凋亡率降低，Bax表达水平降低，Bcl-2表达水平升高，SOD活性升高，MDA水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图2、表3。

与H/R组比较，＊ P<0.05；与H/R+pcDNA组比较，# P<0.05。

表3 各组JHDM1D-AS1、miR-421、心肌细胞凋亡率、SOD活性、MDA水平比较(±s，n=3)

2.4 JHDM1D-AS1和miR-421靶向关系的验证 JHDM1D-AS1和miR-421具有互补的核苷酸序列；wt-JHDM1D-AS1与miR-421共转染的心肌细胞荧光素酶活性降低，而mut-JHDM1D-AS1与miR-421共转染的心肌细胞荧光素酶活性无显著变化。详见图3。

与miR-NC组比较，＊ P<0.05。

2.5 抑制JHDM1D-AS1可逆转苦荞黄酮对H/R心肌细胞损伤及氧化应激的影响 与H/R组比较，H/R+苦荞黄酮组JHDM1D-AS1表达水平升高，miR-421表达水平降低，心肌细胞凋亡率降低，Bax表达水平降低，Bcl-2表达水平升高，SOD活性升高，MDA水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与H/R+苦荞黄酮+si-NC组比较，H/R+苦荞黄酮+si-JHDM1D-AS1组JHDM1D-AS1表达水平降低，miR-421表达水平升高，心肌细胞凋亡率升高，Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低，SOD活性降低，MDA水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图4、表4。

与H/R组比较，＊ P<0.05；与H/R+苦荞黄酮+si-NC组比较，# P<0.05。

表4 抑制JHDM1D-AS1对苦荞黄酮作用的心肌细胞损伤及氧化应激的影响(±s，n=3)

3 讨 论

心肌细胞H/R模型是模拟心肌缺血再灌注损伤及相关疾病的经典细胞模型[8]，因此，本实验用H/R处理心肌细胞建立损伤模型，结果显示，心肌细胞的凋亡率升高，SOD活性降低，MDA水平升高，表明H/R诱导了心肌细胞凋亡和氧化应激。研究报道，苦荞黄酮可通过调节核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路和丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路有效防止高糖诱导的胰岛素抵抗和肝氧化应激[9-10]。苦荞黄酮可改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能[11]。本实验用不同剂量苦荞黄酮处理H/R作用的心肌细胞，结果显示，心肌细胞凋亡率降低，Bax表达水平降低，Bcl-2表达水平升高，SOD活性升高，MDA水平降低。表明苦荞黄酮抑制了H/R作用的心肌细胞损伤。

研究报道，上调JHDM1D-AS1通过磷酸化真核起始因子2α(eIF2α)降低DNAJC10，从而保护牙周膜干细胞免受过氧化氢诱导的凋亡[12]。本实验结果显示，H/R处理心肌细胞中JHDM1D-AS1表达水平降低，过表达JHDM1D-AS1后，心肌细胞凋亡率降低，SOD活性升高，MDA水平降低。表明过表达JHDM1D-AS1抑制了H/R作用的心肌细胞凋亡和氧化应激，提示JHDM1D-AS1有抗细胞损伤作用。且本实验发现JHDM1D-AS1可靶向调控miR-421，研究报道抑制miR-421通过靶向沉默信息调节因子3(Sirt3)保护H9c2细胞免受H/R诱导的氧化应激和细胞凋亡[13]。下调miR-421通过抑制细胞凋亡和氧化应激缓解了脑缺血/再灌注损伤[14]。CircPAN3通过靶向miR-421/张力蛋白同源基因诱导的假定激酶1(Pink1)轴介导的自噬抑制来改善心肌缺血/再灌注损伤[15]。表明miR-421参与H/R诱导的心肌细胞氧化应激和细胞凋亡。提示JHDM1D-AS1可能通过靶向调控miR-421影响心肌细胞损伤。此外，本实验还发现，苦荞黄酮可提高JHDM1D-AS1的表达水平，降低miR-421的表达水平，提示苦荞黄酮可能调控JHDM1D-AS1/miR-421。

综上所述，苦荞黄酮通过调控JHDM1D-AS1/miR-421抑制H/R诱导的心肌细胞损伤。