张辉 邸红芹 吴海峰 孙红梅 孟自立 刘战地

流行性感冒病毒(influenza virus，IFV)是正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，简称流感病毒，为分节段(8个节段)的负链RNA病毒，基于流感病毒核壳蛋白(NP)和基质蛋白(M)抗原决定簇的差异，分为三种不同型：A型、B型和C型，是引起流行性感冒的病原体。流感病毒会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常有周期性的流行，特别是对老人和儿童等人群的生命健康造成了重大威胁[1,2]。其中A型流感病毒(influenza virus A，IFA)和B型流感病毒(influenza virus B，IFB)是引起人感染的主要病毒，甲型流感病毒易发生变异，流感大流行就是就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的[3,4]；乙型流感病毒根据抗原特异性和血凝素(HA1)基因的核苷酸序列，可以分为Yamagata和Victoria两大谱系[5]，其感染特点是起病急骤、畏寒发热，体温在数小时至24 h内升达高峰，39～40℃甚至更高，伴头疼，全身酸疼，呼吸道症状较轻，咽干喉痛。流感病毒是国际上第一个全球监测的传染病毒[6]，国家流感中心每周都会报告新发病例及感染病毒类型，但至今尚未完全控制。流感病毒快速、精确及敏感的诊断，可为临床医师早期有效地抗病毒治疗提供依据，同时高危人群可尽早的采取防护措施，减少病毒在人群中流行。传统的检测方法，如鸡胚组织培养接种以及血清学诊断，由于其操作过程繁琐、灵敏度低以及检测时间较长，无法满足快速诊断的要求，并且病毒抗原的变异频率很高、传播快速为流感病毒的精准诊断和有效防控带来极大的困难。病毒简便、精确及敏感的诊断手段就表现得极其重要。近年来，随着分子生物学检测方法的介入，给临床流感病毒诊断和治疗提供很大的帮助，尤其是多重实时荧光定量PCR技术(MRT-PCR)以其高通量、高灵敏性、高特异性及操作快速简便等优势，在流感病毒诊断中有巨大的应用空间[7,8]。多重PCR体系中存在多对引物和探针，在反应过程中容易造成引物探针交叉干扰，导致扩增效率降低，因此，本文基于同源加尾系统(Homo-Taq Assidted Non-Dimer，HAND)建立改良的Taqmam-分子灯标(Taqman-MB)多重实时荧光定量PCR检测IFA和IFB，以甲/乙型流感病毒核酸检测试剂盒(中山达安基因)为参照，评估已构建的改良多重荧光定量PCR体系在临床检测中的效能[9]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年11月至2019年2月于河北省胸科医院就诊患者261例，其中男161例，女100例；年龄7～89岁，平均(53.22±5.51)岁，为此次研究对象，患者均采集咽拭子标本，置于3 ml病毒保存管中，4℃冰箱保存，24 h内检测。所有入选患者符合体温>37.5℃，并伴有以下症状之一：头痛、关节疼痛、肌肉痛、咳嗽、喉咙痛及流涕乏力等流感样全身症状，此次研究获得了伦理委员会的同意与支持。

1.2 仪器与试剂 本次研究中所用的仪器试剂：Ⅱ级生物安全柜(新加坡esco公司，设备型号LB2-4B1)；低温高速离心机(德国艾本德公司，设备型号5424R)；全自动实时荧光定量PCR仪(美国伯乐公司，设备型号CFX96 Deep Well)；全自动核酸提取仪(德国凯杰公司，设备型号QIAcube connect)；医用冷藏冷冻冰箱(日本松下公司，设备型号MPR-440F)；微量移液器(德国艾本德公司)；核酸提取试剂盒(德国凯杰公司，试剂盒型号RNeasy Mini Kit)；甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法，购自中山达安基因有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取:根据RNA提取试剂盒说明书(凯杰)，提取病毒总核酸，步骤如下：吸取200 μl样本置于核酸提取管内并加入4 μl甲型流感毒/乙型流感病毒内标溶液，放置与核酸提取仪样本盘内，设定好提取程序，进行核酸提取。所提取的核酸应立即检测，若24 h内能检测可置于-20℃冰箱保存，若长期保存需置于-70℃冰箱。

1.3.2 核酸检测:改良多重荧光定量PCR检测体系为25 μl，依次为：预混的PCR反应buffer 17 μl、酶混合液3 μl以及提取的核酸5 μl。PCR反应程序为50℃，15 min(逆转录反应)；95℃，10 min(热启动)；95℃，15 s(变性)，62℃，25 s(退火)，72℃ 20 s(延伸)，5个循环(富集)；95℃，15 s(变性)，62℃，30 s(退火，收集荧光)，72℃ 20 s(延伸)，45个循环(扩增)，检测通道为FAM和HEX。中山大学达安基因股份有限公司生产的甲型和乙型流感病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)根据说明书，简要步骤如下：反应体系为25 μl，其中包括甲流或乙流反应预混液17 μl、酶混合液3 μl以及提取的核酸5 μl。PCR反应程序为，50℃，15 min(逆转录反应)；95℃，10 min(热启动)；94℃，15 s(变性)，58℃，45 s(退火，收集荧光)，45个循环(扩增)，检测通道为FAM，HEX(内标检测通道)。

1.3.3 结果判读:PCR扩增结束后，改良多重PCR结果使用荧光定量PCR仪自带软件进行分析，所有阴性样本的信号值都应低于阈值；若扩增Ct值>35，样本低于检测阈值线，结果判定为甲型或乙型流感病毒核酸阴性；若扩增Ct值≤35，结果判定为甲型或乙型流感病毒核酸阳性。中山达安基因检测试剂盒根据说明书进行结果判读，根据分析后图像调节基线的开始和结束值(一般开始值设定为3～15，结束值可设5～20，调整阴性对照的扩增曲线水平或低于阈值限)，分析结果。如果检测反应体系在FAM通道无扩增或者有扩增曲线且Ct值>39.7，HEX通道Ct值≤44.5，判定为甲型流感病毒阴性，样本未检测到甲型流感病毒核酸，浓度低于检测灵敏度，反之检测Ct值≤39.7，HEX通道有或无扩增曲线，判定为甲型流感病毒阳性，样本检测到甲型流感病毒核酸；如果检测反应体系在FAM通道无扩增或者有扩增曲线且Ct值>38.0，HEX通道Ct值≤44.5，判定为乙型流感病毒阴性，样本未检测到乙型流感病毒核酸，浓度低于检测灵敏度反之，检测Ct值≤38.0判定为乙型流感病毒阳性，样本到乙型流感病毒核酸。

2 结果

2.1 改良多重PCR检测结果判读 PCR扩增结束后，改良多重PCR结果使用荧光定量PCR仪自带软件进行分析，所有阴性样本的信号值都应低于阈值。见表1。

表1 改良多重PCR检测结果判读

2.2 流感核酸检测结果 在261例发热伴流感样症状患者咽拭子标本中，改良多重PCR法检出流感核酸阳性163例，阳性率62.5%，其中甲型流感病毒阳性156例，阳性率 59.8%，乙型流感病毒阳性7例，阳性率2.7%。达安基因试剂盒检出流感核酸阳性169例，阳性率64.8%，其中甲型流感病毒阳性161例，阳性率61.7%，乙型流感病毒阳性8例，阳性率3.1%。改良多重PCR法与达安基因试剂盒检出甲型流感阳性率比较差异无统计学意义(χ2=0.20，P=0.65)，改良多重PCR法与达安基因试剂盒检出乙型流感阳性率比较差异无统计学意义(χ2=0.07，P=0.80)。见表2。

表2 达安基因和改良多重PCR法检测阳性结果比较 例(%)

2.3 改良多重荧光定量PCR性能分析 与达安基因检测试剂盒相比，改良多重PCR检测甲型流感和乙型流感敏感性分别为97.5%和87.5%，特异性均为100%，两种检测方法检测甲型流感病毒(Kappa=0.97，P=0.02)和乙型流感病毒(Kappa=0.93，P=0.07)均具有很高的一致性。见表3。

表3 改良多重PCR法与达安基因试剂盒检测结果比较 例

3 讨论

流行性感冒是由流感病毒引起的常见呼吸系统疾病，其具有爆发突然、高传染性及流行性广等特点[10-12]。流感病毒的快速检测，一方面在早期鉴别诊断中起重要作用，可辅助临床医生尽早的制定合适的治疗方案，控制患者病情发展同时也避免阴性患者的过度治疗，另一方面，可作为流感病毒爆发期高通量、快速筛查地手段，为临床提供依据，及时鉴别流感病毒感染，采取措施阻断流感病毒传播，避免疫情扩大。

常规的检测血清学检测和细胞培养无法早期快速检出流感病毒，多种新的诊断手段被流感用于病毒的诊断，如实时荧光定量PCR[13]、恒温扩增[14-16]以及芯片技术[17-19]等。史志坤[20]讨论了实时荧光定量PCR仪在流感病毒检测中的效果，210例流感样患者标本检测显示荧光定量PCR法检出率要显著高于细胞培养法，可快速有效的检出流感病毒核酸，成为高效简便地诊断方式。荧光定量PCR由于其快速、灵敏、简便及特异等优势，越来越多的研究表明，其可以作为一种检测“金标准”用于流感病毒的鉴定，同时双重、三重甚至多重荧光PCR检测技术的开发与应用，大大提高了病原体的检测效率和检测准确度[21-24]。

为了提高流感病毒检出率和特异性，多种改良优化的检测方法用于流感病毒的检测领域，高蕾等[25]采用具有高扩增效率的逆转录酶进行PCR反应体系优化，进行批间和批内重复性试验，显示优化的RT-PCR反应试剂，缩短了PCR反应时间，具有良好的稳定性和重复性。常晓松等[26]基于荧光免疫层析法建立甲型流感病毒快速检测技术，结果显示荧光免疫层析试剂具有准确度高、检测范围宽、重复性和热稳定性好等优点，可用于流感病毒的快速筛查。本研究构建的多重荧光定量PCR集合了多重PCR和实时荧光定量PCR的优点，可以在单一体系中快速、简便地检测多种靶序列，但是由于PCR反应体系中存在多对引物和探针，在PCR反应过程中会导致引物探针间的交叉干扰，如背景荧光值高和引物二聚体的形成，严重的干扰PCR扩增。

本研究中我们采用了改良的Taqmam-MB探针(Taqman-分子灯标探针)，探针保留了分子灯标探针的茎环结构，使荧光和猝灭基团尽可能的靠近，解决背景荧光高的问题，同时将探针臂也做为序列识别位点，使探针与靶序列结合更加紧密，提高杂交的效率[27]。

此外，我们引入了同源加尾系统(HAND)解决扩增过程中引物二聚体的问题，其原理是：在PCR的初始阶段由于引物较高的溶解温度(Tm值)低浓度的加尾引物特异的与靶序列结合，扩增并富集两头带有Tag的PCR产物，若此时有引物二聚体形成，加尾引物两头的互补序列会构成一个稳定的发夹结构，致使其不能进行扩增，从而极大地减少了引物二聚体对荧光定量PCR的干扰[28]。兰全学等[29]基于同源加尾体系建立快速诊断食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的多重荧光PCR检测体系，临床样本检测显示该方法特异且敏感性高，该方法与国家标准方法对样品的检测结果一致。

本次研究中改良多重PCR体系对流感病毒检出的阳性例数要低于参比试剂盒，存在假阴性的结果，可能是多重PCR体系中引物、模板的竞争性抑制导致体系的检测最低限高于参比试剂盒，统计学分析显示2种方法检测甲型流感病毒和乙型流感病毒阳性检出率均无统计学意义(χ2=0.20，P=0.65和χ2=0.07，P=0.80)。结果表明双重、三重甚至多重荧光定量PCR体系中的干扰因素要多于单重荧光定量PCR检测体系，多重荧光定量PCR需要综合多重扩增体系，势必会牺牲一些检出灵敏度。对改良多重PCR体系进行性能评估，其检测甲型流感和乙型流感敏感性分别为97.5%和87.5%，特异性均为100%，一致性分析显示两种检测方法检测甲型流感病毒和乙型流感病毒均具有高度的一致性(Kappa=0.97，P=0.02和Kappa=0.93，P=0.07)。后续的研究还需要对构建的体系进行的优化，同时应扩大样本量，选择三种及以上相关的商业化检测试剂盒进一步的评估多重荧光定量PCR体系。

综上所述，构建的多重荧光定量PCR体系与达安流感病毒检测试剂盒相比有较高的一致性，可用于快速、高通量筛查流感病毒感染人群，为流感的有效防控提供高效、可靠及精确的技术方法。