伍兰萼 章青青 郭倩 熊卫标

近年来，全球心血管疾病的发病率和病死率呈上升趋势[1]。血管重构是多种心血管疾病的病理基础。先前关于血管重构的研究主要集中在血管内膜和中膜的功能上，包括内皮细胞和平滑肌细胞[2]。最近越来越多的研究关注外膜的作用，外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts，AFs)是外膜中的主要细胞类型[3,4]。研究表明，AFs参与炎性反应、血管重塑和再狭窄[5]。AFs增殖和凋亡的平衡对于脉管系统的生理至关重要[6]。益母草碱是从唇形科植物益母草中提取的有效化合物成分，已被证实具有抗肿瘤和心脏保护的潜力，对急性心肌缺血和心肌缺血再灌注的心肌具有保护作用[7,8]。有研究显示，益母草碱能够抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡，提高细胞增殖活力[9]。目前尚无关于益母草碱对AFs作用的报道，因此本实验旨在探究益母草碱对人脑血管外膜成纤维细胞(human brain vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)增殖和凋亡的影响，并探究其作用机制，以期为益母草碱用于心血管疾病的治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人脑血管外膜成纤维细胞株(HBVAFs)购于美国ScienCell公司；益母草碱、MTT试剂、二甲基亚砜(DMSO)和NF-κB信号通路激活剂佛波酯(PMA)购于美国Sigma公司；DMEM高糖培养基购于美国HyClone公司；AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡试剂盒购于美国BD公司；细胞周期检测试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒和SDS-PAGE凝胶试剂盒购于碧云天生物技术研究所；ECL化学发光检测试剂盒购于赛默飞世尔科技有限公司；NF-κB p65单抗、IKK-α单抗和IKK-β单抗购于美国CST公司；IgG二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 HBVAFs培养 取出冻存的HBVAFs，复苏后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液(含1%青霉素-链霉素双抗)重悬并培养，放置在体积分数为5% CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中，在显微镜下观察细胞生长情况，24 h后更换新鲜培养液，待细胞生长汇合至90%左右时加入胰蛋白酶消化细胞，收集分装进行传代培养，采用第3代的细胞进行后续实验。

1.3 MTT实验检测益母草碱对HBVAFs增殖活力的影响 对数期的HBVAFs接种到96孔板中，过夜培养，待细胞完全贴壁生长后，用不同浓度(0、5、10、15、20 μmol/L)的益母草碱干预细胞，其中对照组为0 μmol/L的益母草碱，空白组只加DMEM高糖培养基不加细胞，各组细胞处理48 h后，每孔细胞依次加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，放置在37℃培养箱继续培养4 h，取出96孔板，吸去细胞上清液，每孔细胞依次加入DMSO 150 μl，振荡反应直至结晶物充分溶解。采用全自动酶标仪测定每孔细胞的吸光度值(A值)，检测波长为450 nm，分别计算各个浓度的益母草碱对HBVAFs增殖能力的影响，细胞增殖率(%)=(药物组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。采用GraphPad Prism 7.0软件计算益母草碱干预HBVAFs 48 h半数抑制浓度(IC50)。

1.4 HBVAFs分组和处理 对数期的HBVAFs接种到6孔板中，实验分为Control组、Leonurine组和Leo+PMA组。其中Control组HBVAFs不加任何处理，Leonurine组HBVAFs以10 μmol/L益母草碱干预48 h，Leo+PMA组HBVAFs以10 μmol/L益母草碱和1 μmol/L NF-κB信号通路激活剂佛波酯PMA干预48 h。3组HBVAFs处理后收集细胞，进行相关检测。

1.5 克隆形成实验检测HBVAFs克隆形成能力 用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞并种植到6孔板中，每孔种植1×103个，吹打细胞至细胞均匀分散，将6孔板放置在常规培养箱中进行培养，14 d左右出现肉眼可见细胞克隆时终止培养，以甲醇固定细胞，以结晶紫染色，洗去染色，晾干后放置在倒置显微镜下随机选择6个视野进行观察，计数≥50个的细胞克隆数，计算各组细胞克隆形成率，克隆形成率(%)=克隆形成数/接种细胞数×100%。

1.6 流式细胞术检测细胞周期 对数期的HBVAFs以3×105个接种到细胞培养皿中，待细胞贴壁后按照上述1.4法分组和处理，48 h后以胰蛋白酶消化并收集细胞，以PBS洗涤细胞，以预冷的70%的乙醇固定细胞24 h，除去乙醇，PBS洗涤细胞，加入含Rnase A的PI染液，避光染色30 min，使用流式细胞仪检测，实验结果采用Modfit软件分析各周期细胞比例。

1.7 AnnexinⅤ-FITC/PI双染色技术检测细胞凋亡情况 对数期的HBVAFs以1×105个/孔接种到96孔板中，培养24 h，除去原培养液，以1.4方法分组和处理，48 h后常规收集细胞，以PBS洗涤细胞，按照AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒使用说明分别加入AnnexinⅤ-FITC和PI染液，混匀后室温下避光孵育15 min，流式细胞仪检测3组HBVAFs凋亡情况。

1.8 Western blot实验检测NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的表达 HBVAFs按照1.4方法分组和处理48 h，收集3组细胞，分别加入适量细胞裂解液，于冰上抽提总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性后行SDS-PAGE电泳，蛋白样品分离后电转至PVDF膜上，将膜置于含5%脱脂奶粉的封闭液中，室温封阻2 h，孵育一抗NF-κB p65(1∶800稀释)、IKK-α(1∶800稀释)和IKK-β(1∶800稀释)，4℃过夜，孵育二抗(1∶3 000稀释)2 h，以ECL进行显影，采用凝胶成像系统拍照，以β-actin为内参，分析各组细胞中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的相对表达水平。

2 结果

2.1 益母草碱对HBVAFs增殖活力的影响 随着益母草碱浓度的升高，HBVAFs增殖率呈明显的浓度依赖性，益母草碱对HBVAFs的IC50为12.55 μmol/L，因此后续实验选择10 μmol/L为加药浓度。见表1。

表1 不同浓度的益母草碱对HBVAFs增殖活力的影响

2.2 3组HBVAFs克隆形成率比较 与Control组比较，Leonurine组克隆形成率明显降低(P<0.05)，与Leonurine组比较，Leo+PMA组克隆形成率明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 3组HBVAFs克隆形成率比较

2.3 3组HBVAFs细胞周期进程比较 与Control组比较，Leonurine组G2/M期细胞比例明显增多(P<0.05)；与Leonurine组比较，Leo+PMA组G2/M期细胞比例明显减少(P<0.05)，G1期和S期细胞比例组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 3组HBVAFs细胞周期进程比较

2.4 3组HBVAFs凋亡率比较 与Control组比较，Leonurine组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，与Leonurine组比较，Leo+PMA组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。见图1，表4。

图1 Annexin V-FITC/PI双染色实验检测HBVAFs凋亡率

表4 3组HBVAFs凋亡率比较

2.5 3组NF-κB p65、IKK-α和IKK-β表达水平比较 与Control组比较，Leonurine组细胞中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β蛋白表达明显下调(P<0.05)，与Leonurine组比较，Leo+PMA组NF-κB p65、IKK-α和IKK-β蛋白表达明显上调(P<0.05)。见图2，表5。

图2 Western blot检测细胞中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的表达

表5 3组HBVAFs中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β表达水平比较

3 讨论

研究发现，外膜细胞在血管重塑中起重要作用[10]。在诸如损伤和细胞因子之类的病理刺激下，外膜中的主要细胞类型(AFs)被激活并发生表型变化，包括增殖和分化为肌成纤维细胞。当肌成纤维细胞的生命周期调节不当时，细胞凋亡的缺乏会导致细胞外基质蛋白沉积的过度产生和病理性血管重塑。此外，这些过程伴随着外膜细胞向内腔的迁移，从而促进了新内膜的形成[11]。不受控制的细胞增殖和细胞凋亡的抑制是血管重构中的关键细胞事件[12]。因此，调控外膜成纤维细胞的增殖和凋亡在血管重塑中发挥重要作用，在多种心血管疾病的防治中扮演重要角色。传统中药如益母草、黄芪、钩藤等在用于临床治疗心血管疾病中效果显著[13]。益母草碱是临床上常用药物益母草的主要药效成分，其具有抗炎、抗细胞纤维化、保护心肌、改善神经功能等多种生物学功能[14,15]。目前研究指出，益母草碱是一类治疗心脑血管新药的候选药物[16]。然而，益母草碱对HBVAFs的影响尚无报道。因此本实验参考以往文献[17]和前期基础实验结果选择不同浓度的益母草碱干预HBVAFs，结果发现益母草碱能够呈浓度依赖性的抑制HBVAFs增殖活力。后续实验以接近益母草碱干预HBVAFs的IC50为加药浓度，实验结果显示，益母草碱能够抑制HBVAFs的克隆形成，阻滞细胞周期至G2/M期，促进细胞凋亡。以上实验结果表明益母草碱能够抑制HBVAFs增殖并促进细胞凋亡。

NF-κB信号通路是一种广泛存在于机体内的信号转导途径，具有多种调节作用[18]。研究发现，心血管疾病与NF-κB信号通路的异常激活密切相关[19,20]。NF-κB信号通路在心室重构、心肌细胞生理病理变化中的作用至关重要[21]。NF-κB与抑制蛋白IκB相互结合形成复合物，该复合物稳定存在于细胞质中，此时NF-κB处于失活状态无调控活性。IKK-α和IKK-β是IκB激酶(IKK)复合物的亚基，当细胞受到外界刺激后，IKK-α被降解，IKK复合物被激活释放NF-κB进入细胞核发挥调控作用[22]。本实验结果显示PMA可上调NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的表达，且能够逆转益母草碱对HBVAFs增殖抑制和凋亡诱导的作用，证实了益母草碱抑制HBVAFs增殖并促进细胞凋亡与NF-κB信号通路的激活有关。

综上，本实验结果显示，益母草碱能够抑制HBVAFs增殖，阻滞细胞周期进程，诱导细胞凋亡，其作用机制与抑制NF-κB信号通路的激活有关。