彭淑莹 王泽骑 陈立强

肇庆医学高等专科学校，肇庆 526060

2 型糖尿病患者由于血糖利用障碍导致高糖高胰岛素血症的发生。前期研究证明胰岛素与胰岛素样生长因子-1 等激素对胰腺β 细胞有反馈抑制功能，因此胰腺分泌胰岛素的能力进一步下降。至今胰岛素分泌的囊泡运输分子机制还未完全阐明，因此深入研究胰岛素分泌的囊泡运输有利于阐明胰岛素的分泌，而且在激活胰岛素分泌过程有着重要意义［1］。研究证明：囊泡膜核苷酸转运体（vesicular nucleotide transporter，VNUT）将 三 磷 酸 腺 苷（ATP）与需转运的分泌蛋白转运到分泌囊泡中，ATP在囊泡中提供能量和驱动势能，在胞吐过程中ATP 与胰岛素同时分泌至细胞外。目前，对ATP转运至囊泡内机制还不明确，而ATP 的供能机制在胰岛素存储与释放中发挥关键作用［2］。因此，对该机制的研究有利于阐述胰岛素分泌的精确机制。2021 年1 月至6 月，本项目旨在利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）干扰VNUT基因，探索该基因对胰岛素分泌的影响。

材料与方法

1、主要试剂

RNA 提取试剂盒、实时定量聚合酶链反应（PCR）购于大连宝生物公司；胎牛血清、细胞培养液购于北京索莱宝科技有限公司；一抗二抗购于上海生物工程公司；大鼠胰腺β细胞（INS-1）是本课题组保存细胞株；大鼠胰岛素检测试剂盒购于美国ALPCO Diagnostics 公司；siRNA 购于ThermoFisher公司。

2、细胞培养和分组

INS-1 按照标准流程进行复苏，细胞在含有10%的胎牛血清的培养基中培养，等细胞生长至大于90%融合时，0.25%的胰酶消化和传代，对细胞进行分瓶传代培养。细胞处于对数生长期时用PBS 洗3 遍，分为对照组和干扰组，将siRNA 转染至细胞，干扰24 h 后检测VNUT 基因RNA 水平变化；干扰48 h 后检测VNUT 基因蛋白表达水平和胰岛素分泌情况。

3、方法

3.1、INS-1 RNA 提取 根据试剂盒操作流程提取INS-1 总RNA，对总RNA 纯度进行检测后，将RNA 置于低温冰箱中保存。

3.2、引物的设计和合成 引物由上海生物工程公司合成并于实验室保存，详细情况见参考文献［3］（表1）。

表1 聚合酶链反应引物表

3.3、VNUT 蛋白水平检测 利用蛋白电泳分子生物学技术对VNUT 蛋白进行检测，通过蛋白识别成像系统进行曝光，系统扫描蛋白条带灰度值，观察对照组和干扰组蛋白水平的差异。

4、统计学分析

采用SPSS 16.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

VNUT 基因被干扰后，基因RNA 和蛋白水平均明显降低，并抑制胰岛素分泌（P＜0.05），见表2。

表2 对照组与干扰组INS-1 VNUT基因表达与胰岛素分泌水平比较（± s）

表2 对照组与干扰组INS-1 VNUT基因表达与胰岛素分泌水平比较（± s）

注：INS-1 按照标准流程进行复苏，细胞在含有10%的胎牛血清的培养基中培养，等细胞生长至大于90%融合时，0.25%的胰酶消化和传代，对细胞进行分瓶传代培养；细胞处于对数生长期时用PBS 洗3 遍，分为对照组和干扰组，将小干扰RNA 转染至细胞。INS-1为大鼠胰腺β细胞

组别对照组干扰组t值P值RNA检测0.452±0.218 0.319±0.116 3.74 0.026蛋白印迹检测0.514±0.297 0.369±0.203 4.82 0.019胰岛素分泌（ng/L）281.45±24.92 176.54±15.70 5.31 0.011

讨 论

siRNA 亦称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20～25 个核苷酸的双股RNA 片段，在生物学上有许多不同的用途［4-5］。目前已知siRNA 主要参与RNA 干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。siRNA 的分子结构现已明确：如具有磷酸化5’末端的短（通常20～24 bp）双链RNA（dsRNA）和具有2 个突出核苷酸的羟基化3’末端。siRNA 经设计合成后可以通过转染引入细胞，在细胞质中经过酶切形成单链RNA，单链RNA 与碱基配对的mRNA 结合并诱导其被切割和失活［6-7］；由于原则上任何基因都可以被具有互补序列的合成siRNA 敲低，siRNA 诱导的转录后基因沉默始于RNA诱导的沉默复合物（RISC）的组装，该复合物通过切割编码靶基因的mRNA分子来沉默某些基因表达［8］，因此siRNA是在后基因组时代验证基因功能和药物靶向的重要工具。

本课题通过设计和合成siRNA 干扰VNUT 基因对INS-1 细胞胰岛素分泌的影响，发现siRNA 干扰VNUT 基因后，VNUT 基因的表达明显降低，而且胰岛素的分泌功能也明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），该结果提示VNUT 基因表达与胰岛素分泌息息相关，探讨VNUT 基因在ATP 转运和胰岛素分泌中的作用机制，为胰岛素分泌的精确机制阐述提供证据支持，2型糖尿病治疗过程中提高胰岛素分泌功能提供参考资料。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突