韩曙光 杜政德 龚树生 柳柯

首都医科大学附属北京友谊医院耳鼻咽喉头颈外科(北京 100050)

耳聋是耳科常见的疾病之一，严重的耳聋可对病人生活质量产生重大的影响，明确聋病发生的原因和机制不仅可提高聋病治疗效果，对聋病的预防也有着重要意义。而这其中，噪声对整个人类的影响都是显而易见的，而且随着人类社会生产力的不断提高，工业，交通，娱乐等各行各业所产生的噪声也随之增多，这些潜伏在人类周边的噪声无时不刻不在影响人们的听觉系统，造成听觉损害[1]。而这其中，隐匿性听力损失动物模型逐渐成为学者的研究热点。本课题组通过不同的噪声暴露方式，研究对C57小鼠听力的影响，构建C57小鼠不同程度的耳聋模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

本课题组所用小鼠均为5周龄的C57BL/6J小鼠，雄性，体重15-18g。先于动物房进行适应性饲养1周，饲养环境噪声控制在40dB以内。所有小鼠观察活动性及营养状态良好，耳廓反射灵敏，实验所纳入小鼠均排除外耳异常及中耳炎。实验动物被随机分为对照组（A）、一次噪声暴露组（B），二次噪声暴露组（C）和三次噪声暴露组（D），每组6只小鼠。

1.2 噪声暴露

实验采用Cool Edit Pro合成白噪声，放大后通过音响进行释放，强度100dBSPL，暴露时间2小时，鼠笼置于两个音响正中，声级计监测暴露过程中噪声强度变化不超过1dB。对照组不进行噪声暴露。B组于day1进行噪声暴露一次；C组于day1，day3进行两次噪声暴露；D组于day1，day3，day5进行三次噪声暴露（见图1）。

图1 动物分组及噪声暴露和ABR检测Fig.1 Animal grouping,noise exposure and ABR test

1.3 听功能检测

对小鼠进行ABR测试，均进行左耳测试。对照组A分别于day1和day14测试听力。噪声暴露组分别于噪声暴露前、最后一次噪声的当天，暴露后第7天和第14天测试ABR。ABRI波振幅在最后一次噪声暴露的第14天测试，于click声90dBSPL刺激条件下，基线由系统软件自动识别，辨认I波波峰及波谷并定标，软件自动计算I波振幅。

1.4 耳蜗形态学观察

听力学检查后处死小鼠，取双侧耳蜗固定，脱钙，蔗糖梯度脱水后进行包埋，于冰冻切片机内以层厚10μm进行组织切片，近蜗轴处留片备用，风干后梯度脱水，HE染色后进行耳蜗基底膜毛细胞和螺旋神经节细胞计数。毛细胞计数：每个耳蜗标本中轴处连续留片10张，以细胞核，细胞质完整为存活标志进行毛细胞计数。螺旋神经节细胞计数则间隔3张取片以避免细胞重复计数，每只耳蜗可挑选出3张切片。螺旋神经节细胞以底转起始段，终末段，及中转段三处进行网格法计数。以对照组计数为标准进行试验组存活率计算，统计三次取平均值。

1.5 统计分析

记录各个时间点ABR阈值及I波振幅，内耳毛细胞及神经节细胞存活率，所有实验数据以均数±标准差(±s)表示。噪声暴露前后不同时间点ABR阈值，暴露后第14天ABRI波振幅，及耳蜗细胞存活率均进行配对样本t检验，以P<0.05具有显著统计学差异。

2 结果

2.1 单次噪声暴露小鼠听力学及内耳形态学改变

首先对照组进行听力测试，day1和day14听力分别为17.08±2.46，17.28±2.86dBSPL，I波振幅分别为3.31±0.37和3.28±0.26μV，均无统计学差异。B组单次噪声暴露后day1听力明显升高，且以24k和32k听力损失最为严重。day7听力部分恢复，day14时click及各个频率听力阈值均与day1无明显差异（表1），但ABRI波振幅降低（图2），为2.23±0.36μV，与暴露前振幅统计学差异明显（P<0.01）。耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞计数均与对照组无明显差异（图3）。

表1 噪声暴露组各时间点ABR阈值Table 1 ABR threshold at each testing time among group B～D

2.2 二次噪声暴露小鼠听力学及内耳形态学改变

C组噪声暴露后第一天听力明显升高，以24k最为明显，噪声暴露后第7天听力没有出现恢复趋势，反而进一步加重，其中16k的听力损失加重最为明显。而暴露后第14天，听力部分恢复，但仍与噪声暴露前有明显降低（表1），ABRI波振幅为2.13±0.34μV（图2），较对照组明显降低（P<0.01）。耳蜗内毛细胞及螺旋神经节细胞计数保持稳定，但是外毛细胞可见丢失，排列不齐等，且外毛细胞存活率（95.45%）较对照组下降（P<0.01，图3）。

2.3 三次噪声暴露小鼠听力学及内耳形态学改变

D组小鼠噪声暴露后第一天听力明显升高，24k受损明显，噪声暴露后第7天听力损失亦进一步加重，其中16k的听力损失加重最为明显。而暴露后第14天，听力部分恢复，但仍与噪声暴露前有明显损失（表1），ABRI波振幅为1.82±0.47μV（图2），较对照组明显降低（P<0.01）。耳蜗内毛细胞及螺旋神经节细胞计数仍无明显变化，外毛细胞丢失则更为显著，外毛细胞存活率（90.45%）较对照组明显下降（P<0.01，图3）。

图2 各组day14ABR I波振幅Fig.2 ABR wave I amplitude

图3 各组耳蜗切片及细胞计数（耳蜗中轴切片内毛细胞及螺旋神经节细胞计数各组均无统计学差异，外毛细胞单次噪声暴露后变化不大，随着暴露次数增加丢失严重。红色箭头示外毛细胞丢失部位）Fig.3 Cochlear sections and cells count(inner hair cells and spiral ganglion cells count had no statistical difference com‐pared with group A,outer hair cells kept stable in group B,and decreased with the increasing number of noise exposure.B:t=0.229,P=0.828;C:t=-9.783,P=0.000;D:t=18.407,P=0.000.**P<0.01.Red arrows showed the fragmentary outer hair cells)

3 讨论

听力损失一般定义为听觉对声刺激的敏感度下降，即听觉阈值升高。但是近年来，随着人们对听觉系统研究的深入，发现一部分患者在噪声暴露之后，虽然在噪声环境下出现了言语识别困难的现象，但是常规的听力检测手段并不能发现异常。同时在深入的动物实验研究中，人们发现噪声暴露之后，耳蜗毛细胞的损伤在特定强度的噪声暴露之后会出现可逆性恢复，但是内毛细胞与螺旋神经节纤维之间的突触在不同程度上是不可逆损失的，同时电生理检测结果同样显示了未累及听力阈值。因此，把这种不易被察觉的听觉系统损害称之为隐匿性听力损失[2]，而噪声诱导的隐匿性听力损失现在是耳科的基础研究热点。

CBA或豚鼠小鼠用来构建噪声诱导的隐匿性听力损失是国外各实验室常规采用的办法，但是大家所采取的噪声暴露模式并不相同。Liberman[3]实验室动物实验结果发现，相对较低强度的窄带噪声短时暴露后（106dBSPL，2h)，小鼠的ABR阈值在一周内恢复正常，但ABR和听神经复合动作电位的幅度却未能恢复到噪声暴露前的水平。Kujawa[3,4]等采用100dBSPL强度的倍频带噪声（8-16kHz）暴露2h，发现在高频区，在噪声暴露之后2h就可以检测到最大40dB的阈移，而这些阈移在14天均基本都能够恢复正常。尹彦波[5]，Shi[6]等人采用CBA/CaJ小鼠也可以得到NIHHL动物模型。

在C57小鼠中尚没有肯定的隐匿性耳聋的动物模型。Kevin D.Brown[7]采用C57小鼠来研究烟酰胺核糖对听力的保护作用，使用90dB的倍频噪声作为暴露条件，进行2h的噪声暴露，发现噪声暴露24h之后，出现了明显的听力下降，听力阈值改变一直持续到了噪声暴露后的第14天，并没有随着时间延长而彻底恢复，因为认为C57小鼠对噪声敏感，对于特定条件下的噪声暴露产生了永久性阈移，不能认为是隐匿性听力损失。有意思的是，他们实验室也采用了CBA小鼠来进行同样噪声模式的暴露，发现最终也有部分不可逆的听力损失，这与其他实验室采用CBA小鼠进行噪声诱导的隐匿性听力损失模型的构建有所冲突。近年来，国内学者开始尝试使用C57小鼠来进行噪声暴露，试图构建隐匿性听力损失，其中，柳柯[8]等学者采用100dB的白噪声来进行听力暴露，认为可以获得较为稳定的隐匿性听力损失模型。虽然噪声强度甚至比Kevin D.Brown等实验室还要强，但噪声方式为宽频白噪声，这种噪声可能在频率的能量分配上，相对于倍频噪声在特定频率范围内集中作用于耳蜗，对内耳的损失更小。本实验试图重复并验证这种动物模型的构建情况，并给于多次噪声暴露，来观察听力的进一步损失情况。

在我们的研究中，多次噪声暴露均产生了不可逆恢复的永久性阈移，即认为是噪声性耳聋模型，并观察到内耳形态学的损伤。在首次噪声暴露的基础上，给予多重噪声暴露，小鼠听力进行性下降，并在14天后仅可观察到部分的听力恢复，这种未能恢复的听力阈移称之为永久性阈移。有意思的是，与单次噪声暴露不同，多次噪声暴露在第7天，听力损失仍然呈现进行性加重趋势，而不像单次噪声暴露，在第7天就已经开始了听力的恢复阶段，而是在day7-14阶段才开始有听力的部分恢复。这可能与噪声对听力损害的累积作用有关，提示过强噪声对小鼠听觉系统的损伤时间和程度更为严重。通过对频率特异性的ABR检测发现，噪声对高频区的听力影响更为严重，24k及32k听力损失在噪声暴露后第一天最为明显，同时16k听力损失相对较轻。而在此基础上遭受再次噪声暴露，16k听力阈移最为明显，到14天时恢复程度也相对较大。同样在耳蜗切片上也观察到，相对于顶转Corti氏器，底转Corti氏器外毛细胞的损伤更为明显。

接下来，我们评估ABR I波振幅的变化。I波起源于内毛细胞与螺旋神经纤维之间的突触动作电位，代表了与IHCs接触的听觉神经纤维的总和活动。我们发现单次噪声暴露后第14天，虽然暂时性阈移已经完全恢复正常，但I波振幅并不能恢复，因此证明噪声对听觉系统仍有一定程度不可逆的损害。多次噪声暴露后，I波振幅也有不同程度降低。因此C57小鼠采用特定的噪声暴露可以成功的构建噪声诱导的隐匿性听力损失的动物模型。

对耳蜗切片观察可以发现，单次噪声暴露于对照组，并无明显差异，但随着噪声暴露次数的增加，外毛细胞丢失逐渐加重，内毛细胞和螺旋神经节细胞则基本保持稳定，说明外毛细胞对于噪声性损伤更为敏感，而螺旋神经节细胞的凋亡则是继发于毛细胞损伤后的延迟反应，一般在数月后才会发现。我们的研究采用C57小鼠，构建了稳定的噪声诱导的隐匿性听力损失模型，并通过多次噪声暴露构建噪声性耳聋模型。根据目前的安全标准，隐匿性耳聋的临床影响对人群的影响更大，这些人群暴露在被认为是安全的噪音中[9]，而这些噪声对人的听觉系统仍是有危害的。稳定的动物模型对于进一步研究隐匿性耳聋机制及应对保护措施提供了良好的基础。