魏姜勉

（黄淮学院生物与食品工程学院，河南驻马店 463000）

牛奶营养成分丰富，包括丰富的蛋白质、各类维生素和钙质等营养元素，在增强人体免疫力，治疗人体动脉硬化、高血压和骨质疏松中发挥重要效用，为人体运动提供丰富的能量来源。随着社会经济的不断发展，以及人们的生活改善，牛奶出现供不应求的现状，拓展了牛奶市场的发展空间（董顺华，2020）。近年来，乳源性疾病在奶牛中不断爆发，人们对牛奶质量格外重视，因此，牛奶安全问题已成为人们最为关注的焦点。研究发现，少部分黄曲霉毒素在牛奶样品中被检测出来，而黄曲霉毒素是真菌代谢产生的二级代谢物，广泛存在于饲料、谷物和食品中。近些年来，学者发现，动物饲料中的霉菌毒素污染情况与牛奶质量息息相关。奶牛一旦摄入的饲料中含有少量黄曲霉毒素，会给奶牛带来营养不良、免疫力下降等问题，给乳制品带来安全隐患（关一凡等，2019；白阳等，2019；王倩，2019；孙瑞涛等，2019）。

黄曲霉毒素M1是奶牛饲料中携带的黄曲霉毒素B1被奶牛摄入体内发生化学反应的产物，黄曲霉毒素M1主要存在于奶牛的乳、肝、肾脏和血液中。牛奶中存在部分黄曲霉毒素M1，化学性质稳定，在乳制品生产和贮藏中含量不会发生明显变化，不受消毒剂的影响（查满千等，2019）。而牛奶和乳制品作为食品，对黄曲霉毒素的限量极为严格。目前，测定黄曲霉素毒素的方法有高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法和放射免疫测定法，这些方法操作过程繁琐、检测周期长、灵敏度低，黄曲霉毒素M1的标准物质较难获取，结果精确度低（王丽和刘文娇，2018）。因此，本研究采用免疫亲和柱-荧光光度计法测定动物体内黄曲霉毒素M1含量，更好地测定饲料和动物体内的黄曲霉毒素含量；本研究检测奶牛常规饲料（青绿饲料、粗饲料、能量饲料、蛋白饲料）的黄曲霉毒素含量，以便分析奶牛饲料污染情况，以及其对牛奶品质的影响程度。

1 材料与方法

1.1 实验材料 牛奶样品，青绿饲料，粗饲料，能量饲料，蛋白饲料。

1.2 实验试剂 甲醇（纯度高），氯化钠（分析纯），0.02%溴水储备液，溴水使用液体，二水硫酸奎宁，硫酸溶液，黄曲霉毒素的标准溶液，三氯甲烷，无水硫酸钠。

1.3 实验设备 荧光光度计，离心机，试管，烧杯，分液漏斗，滤纸，粉碎破碎仪，涡旋离心机，酶标仪，电动振荡仪器，普通和精密移液枪。

1.4 黄曲霉素M1检测方法 黄曲霉素M1检测采用免疫亲和柱-荧光光度法。

1.4.1 牛奶样品预处理 牛奶样品加入一定量氯化钠，用离心机离心牛奶样品，对牛奶进行脱脂处理，而后过滤。

1.4.2 免疫亲和柱洗脱 将免疫亲和柱连接玻璃注射器中，调节液体流速清洗柱子，对混合液进行洗脱纯化。

1.4.3 结果测定 在待测样品中加入黄曲霉毒素M1标准溶液，依据上述操作获得分离纯化的洗脱液，再加0.002%溴溶液，将标准样品放入荧光光度计中测定黄曲霉毒素M1溶液的荧光强度，且绘制黄曲霉毒素M1标准浓度曲线，将待测溶液放入荧光光度计中黄曲霉毒素M1的荧光光度，根据标准曲线计算黄曲霉毒素M1的含量。

1.5 饲料中黄曲霉素B1检测方法

采用酶联免疫法进行测定。

1.5.1 饲料样品提取与加标 将饲料样品放入无菌烧杯中均匀混合，经过滤后放入50 mL磨口试管中作为对照组提取液。将样品提取液各自取4 mL放入试管中，再加入一定量的黄曲霉毒素B1标准溶液，使用涡旋机进行涡旋，作为对照组的样品提取液。

1.5.2 样品测定 在酶标板上加入50 μL的黄曲霉毒素 B1标准溶液，标准溶液浓度（0、0.5、2、9、15 ng/ mL），其余各孔中加入50 ul样品提取液，再分别加入50 μL酶标抗原溶液，放入37℃恒温培养箱孵育2 h后，样品中分别加入50 μL显色剂，用酶标仪（500nm）测定牛奶样品各孔吸光度值。

1.6 计算方法

1.6.1 黄曲霉素M1计算方法 黄曲霉毒素M1计算公式如下：

A=CV/M

式中：A表示样品中黄曲霉毒素M1含量，μg/kg；C表示样品中黄曲霉毒素M1的浓度，ng/mL；V表示样品的定容体积，mL；M表示样品的质量，g。

1.6.2 黄曲霉毒素B1的计算方法 建立线性方程来计算黄曲霉毒素B1的含量：用黄曲霉毒素B1标准溶液的平均吸光度值A与标准溶液A0的比值为线性方程的纵坐标，黄曲霉毒素B1标准溶液浓度的对数为横坐标，从而建立线性方程。待测样品的吸光度值除以标准溶液A0的吸光度值，将其放入线性方程求出标准溶液的横坐标值，用对数计算公式来计算标准溶液的浓度，与稀释倍数相乘即可得到黄曲霉毒素B1的含量，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 黄曲霉毒素M1荧光光度计波长的测定 本研究使用荧光光度计检测样品中黄曲霉毒素M1的光谱信息，确定本实验中黄曲霉毒素M1被激发，最佳的荧光光度计发射波长为550nm。

2.2 黄曲霉毒素M1的检测方法精确度分析 本实验根据实验方法对黄曲霉毒素M1的含量进行检测，确定样品实验添加范围为0.03 μg/L，这个数值范围符合国际限量标准；牛奶样品中添加黄曲霉毒素M1的安全量为0.05 μg/L，根据上述实验开展10次重复实验，实验结果显示，样品中黄曲霉毒素M1的平均值为0.046 μg/L，标准误差为0.0045，该实验结果表明，黄曲霉毒素M1的检测方法较为精确。

2.3 牛奶样品的回收率测定 本研究是以阴性样品为对照组，在不同阴性牛奶样品中添加不同浓度的黄曲霉毒素M1，每组实验为5个平行，分析不同浓度梯度对牛奶样品回收率的影响，由表2可知，不同浓度的黄曲霉毒素（0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 μg/kg）添加到牛奶样品中，不同添加水平牛奶样品的黄曲霉毒素M1的平均含量分别为 0.23、0.53、0.80、1.03 和 1.40 μg/kg；牛 奶 样品中黄曲霉毒素M1的含量为0.3 μg/kg时，牛奶样品的平均回收率最小，为76.67%；牛奶样品中黄曲霉毒素M1的含量为1.5 μg/kg时，牛奶样品的平均回收率最大，为93.33%；随着牛奶样品中黄曲霉毒素M1添加量的增加，牛奶样品中的变异系数先上升后下降，牛奶样品中黄曲霉毒素M1的含量为0.9 μg/kg时，牛奶样品的变异系数最大，为2.8%；牛奶样品中黄曲霉毒素M1的含量为0.3 μg/kg时，牛奶样品变异系数最低，为0.45%。

表2 添加不同水平的黄曲霉毒素M1对牛奶样品回收率的影响

2.4 不同类型饲料原料样品的黄曲霉毒素B1测定 本研究参照上述实验方法，对不同类型饲料中黄曲霉毒素B1的含量进行计算，结果如表3所示。由表3可知，青绿饲料、粗饲料、能量饲料和蛋白饲料等样品的阳性样品中黄曲霉毒素B1的测定率为100%，在青绿饲料样品中黄曲霉毒素B1的最大值是 12.34 μg/kg，最小值是 2.56 μg/kg；粗饲料样品中黄曲霉毒素B1的含量是11.68 μg/kg，最小值是1.24 μg/kg；能量饲料样品中黄曲霉毒素B1的含量是9.86 μg/kg，最小值是0.68 μg/kg；蛋白饲料样品中黄曲霉毒素B1的含量是9.36 μg/kg，最小值是 2.09 μg/kg。饲料污染程度参照黄曲霉毒素制定的国际标准，如表1所示，而青绿饲料、粗饲料、能量饲料和蛋白饲料阳性样品中黄曲霉毒素B1的平均含量分别为11.45、4.25、5.24 和 7.58 μg/kg，小于 20 μg/kg，均属于为轻度污染。

表1 黄曲霉毒素B1污染程度和标准

表3 不同类型饲料中黄曲霉毒素B1的测定

2.5 不同污染饲料饲喂奶牛后，牛奶样品黄曲霉毒素M1的测定结果 由表4可知，被黄曲霉毒素B1污染的青绿饲料、粗饲料、能量饲料和蛋白饲料饲喂奶牛后，牛奶样品中黄曲霉毒素M1阳性测定率分别为98.7%、95.6%、94.6%和93.4%；青绿饲料的牛奶样品中黄曲霉毒素M1的最大含量是 0.167 μg/kg，最小含量是 0.005 μg/kg；粗饲料的牛奶样品中黄曲霉毒素M1的最大含量是0.187 μg/kg，最小含量是0.009 g/kg；能量饲料的牛奶样品中黄曲霉毒素M1最大含量是0.197 μg/kg，最小含量是0.004 μg/kg；蛋白饲料牛奶样品中黄曲霉毒素M1最大含量是0.201 μg/kg，最小含量是0.008 μg/kg。不同饲料中牛奶样品的黄曲霉毒素M1的平均值分别为0.057、0.084、0.068和0.073 μg/kg。在本研究中，不同类型饲料的牛奶样品中黄曲霉毒素M1的测定率不同，青绿饲料牛奶样品中阳性样品测定率最高，结果表明，奶制品中的霉菌毒素污染源头主要为青绿饲料。目前，我国卫生部对乳制品的黄曲霉毒素M1含量限制为0.05 μg/kg，而本研究中牛奶样品阳性最高值为 0.201 μg/kg，最低值为 0.004 μg/kg，平均值最大为0.084 μg/kg，严重超过我国卫生部门制定的标准。

表4 不同类型饲料中牛奶的黄曲霉毒素M1的测定

3 讨论

3.1 黄曲霉毒素M1测定方法的影响因素分析 本研究采用免疫亲和柱-荧光光度法对不同类型饲料牛奶样品中黄曲霉毒素M1的含量进行测定。样品中黄曲霉毒素M1属于一种免疫抗原，可在动物体内形成一定量的抗体，该抗体用于免疫亲和柱中，便于吸附黄曲霉毒素M1。免疫反应的抗体具有单一识别抗原能力强和灵敏度高等特性，免疫亲和柱的单克隆抗体可有效吸附牛奶样品黄曲霉毒素M1，用离心机离心和滤膜过滤后，将会提高样品中黄曲霉毒素M1的纯度，从而提高黄曲霉毒素M1测量的精准度。免疫亲和柱被应用于食品中霉菌的分离和净化，且柱内单克隆抗体专一识别样品中黄曲霉毒素M1，两者进行高度结合，避免其他外来物质的干扰，可高度特异地识别外来牛奶样品的霉菌毒素，具有溶剂使用量少，再生利用等特点（王新红，2018）。

本研究采用荧光光度法检测牛奶样品中黄曲霉毒素M1含量，精准含量为0.0001 μg/kg，且牛奶样品中黄曲霉毒素M1的添加水平为0.3～1.5 μg/kg，牛奶的回收率范围76.67%～93.33%，变异系数为0.45%～2.8%，满足我国制定的检测标准。荧光光度法中样品检测速率极快，操作便捷、准确、高效和安全，且仪器设备小，便于携带，度数稳定，结果灵敏度高。荧光光度法一种高效检测样品霉菌毒素含量的方法，为样品中霉菌毒素含量的检测提供理论基础。

3.2 饲料中黄曲霉毒素对牛奶品质影响的分析 黄曲霉毒素是一类真菌代谢产生的毒素，对动物生长发育和肝脏产生重大损害（刘康和张佩华，2018）。畜禽类动物食用黄曲霉毒素污染的饲料后会引起动物中毒，给畜牧业带来重大的经济损失。董顺华（2020）等研究发现，饲料中出现霉菌毒素污染会对奶牛器官、产奶量及牛奶安全和品质产生不良反应。而黄曲霉毒素是动物饲料中的霉菌种类之一，但牛奶品质也会受动物年龄、饲料含量及外部环境等因素影响。查满千等（2019）研究发现，奶牛投喂0.04 μg/kg的黄曲霉毒素会降低生产性能和免疫机能，当饲料没有黄曲霉毒素时，奶牛生产性能较好，产奶量增加35%；刘康（2018）等研究发现，饲料中添加少量的黄曲霉毒素会降低奶牛的产奶性能。本研究发现，奶牛摄入饲料中的黄曲霉毒素B1，经体内发生羟基化形成M1形式。

饲料是奶牛赖以生存的物质基础，为牛奶提供充足的营养，奶牛良好的生产性能取决于良好的饲料配方，牛奶品质与奶牛产能息息相关。营养丰富的饲料是奶牛生产优质牛奶的物质基础（白阳等，2019；孙瑞涛等，2019）。建立高效安全的饲料产业是安全牛奶的重要保障。奶牛饲料在加工过程中要及时处理污染饲料，加强对饲料质量的监督和管理；饲料利用生物脱毒方法，安全高效地去掉饲料中的霉菌毒素；及时管理饲料霉变，及时处理霉变饲料；在饲料投喂环节，及时处理残存饲料，降低饲料污染率，提高奶牛饲料的安全性，发展健康、安全、优质的饲料，进而提高牛奶质量（王倩，2019）。

本研究中发现饲料中黄曲霉毒素B1属于轻度污染，而牛奶中黄曲霉毒素M1严重超过国家卫生部门制定的标准。霉菌污染是影响畜牧饲料业发展的关键因素，也会对牛奶品质产生重要的影响。奶牛饲养过程中，黄曲霉毒素对奶产品的影响程度较大，面对奶产品的需求量不断扩大，因此，应加强饲料管理，及时检测饲料污染物情况和预防霉菌污染，减少饲料中黄曲霉毒素的含量，保障奶牛健康和牛奶品质。

4 结论

黄曲霉毒素是饲料中常见的污染毒素之一，严重影响奶牛的健康和牛奶品质。本研究发现，可采用免疫亲和柱-荧光光度法检测黄曲霉毒素M1含量，该方法简单、高效、安全和灵敏度高，检测速度快，满足牛奶样品的检测需求。本研究对奶牛饲料中青绿饲料、粗饲料、能量饲料和蛋白饲料中的黄曲霉毒素B1及牛奶样品中的黄曲霉毒素M1的含量进行测定，发现饲料样品属于轻度污染，而牛奶样品严重超过国家相关部门制定的标准，污染程度较大；饲料中黄曲霉毒素B1经奶牛摄食后形成牛奶中的黄曲霉毒素M1。为了保证人体健康，饲料生产过程中应注意控制霉菌毒素的产生，加强饲料的安全品质管理，提高牛奶质量。