盛佳钰，李春阳，江科，薛晓红

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院乳腺病科，上海 200437)

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，50%～60%乳腺癌患者属于激素依赖型[1]，该类型乳腺癌患者保留全部或部分激素受体及其功能，其发生和发展受内分泌的影响及调控。针对激素受体阳性的乳腺癌患者，内分泌治疗是常见的治疗方式。作为一线内分泌治疗药物——选择性雌激素受体调节药(selective estrogen receptor modulators，SERMs)，他莫昔芬(tamoxifen)、枸橼酸托瑞米芬(toremifene)在抑制雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性的乳腺癌细胞生长的同时，却刺激ER阳性的子宫内膜细胞增生，子宫内膜腺体表现囊性扩张样水肿或形成息肉，间质胶原丰富，而腺上皮细胞萎缩或化生，使子宫内膜呈现出了息肉-增生-恶性变等多样的变化[2]。对于内分泌治疗药物引起的子宫内膜病变，临床常采用诊断性刮宫治疗，目前尚缺乏有效而无创的治疗方法，往往导致患者治疗依从性差。在临床实践中，笔者发现同期应用内分泌药物治疗的乳腺癌患者，其子宫内膜病变表现参差不齐。

雌激素主要通过与α受体结合发挥作用，雌激素受体α(ERα)的基因多态性可以改变雌激素受体的表达水平及功能，从而影响雌激素的生物学效应。众多研究均表明[3-5]，ERα基因(主要是第一内含子上两个限制性片段rs9340799、rs2234693)多态性与发生子宫内膜病变的风险显著相关。因此，本研究将探索 rs9340799、rs2234693位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)与他莫昔芬引起的子宫内膜病变的相关性，试图从中筛选出容易发生药物性子宫内膜病变的基因类型，以尽早预防乳腺癌内分泌治疗药物引起的子宫内膜病变的发生并为绝经前乳腺癌患病群体的精准治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1临床资料 所有病例来自上海中药大学附属岳阳中西医结合医院乳腺病科2018年3—9月期间门诊及住院的乳腺癌患者，共164例。纳入标准：①长期居住在长三角地区组患者之间无亲缘关系；②符合乳腺癌诊断标准，并经病理细胞学诊断证实；③进行他莫昔芬或托瑞米芬药物治疗>1年的患者；④完成知情同意及相关告知。排除标准：①无明确乳腺癌病理诊断者；②子宫、卵巢切除者或使用促黄体生成素释放激素类似物者；③合并子宫内膜基础疾病者及心血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病者；④曾经发生过子宫内膜不良事件者；⑤未完成知情同意及相关告知。164例患者平均年龄(46.85±5.90)岁；接受内分泌治疗1～2年、>2～3年、>3～4年、>4～5年及>5年分别有68，46，23，18，9例；其中病理诊断为浸润性癌的139例，原位癌25例；使用他莫昔芬78例，枸橼酸托瑞米芬86例。各基因型组临床资料基线均衡，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2ERα基因SNPs 位点检测 所有入组对象均抽取清晨空腹外周静脉血2 mL，置于无菌无酶的乙二胺四乙酸抗凝试管，存放于-20 ℃环境。引物均由生工生物工程(上海)有限公司设计并合成，如下：rs9340799-FO 5′-GCAGGCTGGGCTCAAACTA-3′，rs9340799-RO 5′-CTTTCATTACCTCTTGCCGTCT-3′，rs2234693-F 5′-ATCCAGGGTTATGTGGCAAT-3′，rs2234693-R 5′-CTAATAGACTTAATGTTTTTGCAGG-3′。

对目标片段进行聚合酶链反应(PCR)扩增，PCR反应体系为25 μL，其中基因组DNA模板1 μL，巢式引物Fi 0.5 μL，巢式引物Ri 0.5 μL，dNTP混合物(10 mmol·L-1)0.5 μL，Taq反应缓冲液2.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1) 0.2 μL，水20 μL。PCR反应体系首先在95 ℃预变性3 min，然后进行35个循环扩增(每个循环包括 94 ℃变性30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃ 延伸30～60 s)，循环完毕后进行72 ℃ 修复延伸 10 min。

PCR产物送于生工(上海)生物工程有限公司进行单向测定，测序仪型号为 3730XL (美国 ABI)，结果使用Chromas 软件分析，见图 1。

图1 ERα基因位点测序图 Fig.1 Sequencing map of ERα gene site

1.3子宫内膜病变观察 B超检查观察子宫内膜厚度，统计行阴道诊刮患者例数，计算子宫内膜诊刮率。

1.4统计学方法 采用 SPSS 21.0版 统计软件进行统计分析，采用PLINK -doc -1.04 对患者测序结果进行 Hardy -Weinberg 遗传基因分布平衡检验。各基因亚型组间的计量和计数资料差异比较采用方差分析和卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1ERα基因rs9340799、rs2234693位点基因型和等位基因分布 164例患者中，ERα基因rs9340799位点，A、G等位基因的分布频率分别为79%和21%；其中A/A型实际频数106例，A/G型48例，G/G型10例(P>0.05)。ERα基因rs2234693位点中C、T等位基因的分布频率为42% 和 58%； 其中C/C型实际频数为32例、C/T型为74例、T/T型为58例(P>0.05)，说明样本具有群体代表性。

2.2ERα基因SNPs与子宫内膜厚度及内膜诊刮比例的关系 比较 ERα基因rs9340799位点各基因型患者间子宫内膜厚度的差异，发现该位点的3种基因型(A/A、A/G、G/G)组间子宫内膜厚度值差异有统计学意义(F=3.382 0，P<0.05)；在G显性模式下，即A/G、G/G基因型患者子宫内膜厚度[(9.63±3.53) mm、(9.00±0.89) mm]均高于A/A基因型患者[(7.73±3.04) mm]。而A/G基因型比A/A基因型患者子宫内膜更厚(F=3.614 0，P<0.05)。比较 ERα基因rs2234693位点各基因型患者间子宫内膜厚度的差异，发现该位点的3种基因型(C/C、C/T、T/T)组间子宫内膜厚度值差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 ERα基因SNPs与子宫内膜厚度的关系 Tab.1 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial thickness

比较 ERα基因rs9340799位点各基因型患者间子宫内膜诊刮比例的差异，发现该位点的3种基因型(A/A、A/G、G/G)组间子宫内膜诊刮比例差异有统计学意义(χ2=20.750 0，P<0.05)。其中，A/G基因型患者子宫内膜诊刮比例(45.83%)高于A/A及G/G基因型患者(15.09%，0.00%)(χ2=16.800 0，7.384 0，P<0.01)。 较ERα基因rs2234693位点各基因型患者间子宫内膜诊刮比例的差异，发现该位点的3种基因型(C/C、C/T、T/T)组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 ERα基因 SNPs 与子宫内膜诊刮比例的关系 Tab.2 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial diagnostic curettage rate

2.3ERα基因SNPs 与不同内分泌药物治疗患者子宫内膜厚度及内膜诊刮比例的关系 根据患者服用药物不同，将患者分为他莫昔芬组和枸橼酸托瑞米芬组，比较 ERα基因rs9340799位点及rs2234693位点各基因型患者间子宫内膜厚度及诊刮比例的差异是否与服用的内分泌药物种类有关。发现同一基因型患者，不同药物组间无论是子宫内膜厚度还是诊刮次数均差异无统计学意义(P>0.05)。

但是，在接受枸橼酸托瑞米芬治疗的患者中，子宫内膜厚度与 rs9340799位点SNPs存在相关性，A/G基因患者的子宫内膜厚度较纯合基因型A/A、G/G型厚(F=1.553 0，P<0.05)，见表3。且无论是他莫昔芬还是枸橼酸托瑞米芬组，rs9340799 位点SNP与内膜诊刮率均呈显著相关性(χ2=13.690 0，16.850 0，P<0.01)，见表4。

表3 ERα基因 SNPs 与不同内分泌药物子宫内膜厚度的关系 Tab.3 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial thickness in patients treated with different endocrine drugs

表4 ERα基因 SNPs 与不同内分泌药物治疗患者子宫内膜诊刮率的关系 Tab.4 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial scraping rate in patients treated with different endocrine drugs

2.4ERα基因SNPs与首次子宫内膜诊刮时间的关系 根据接受内分泌药物治疗发生首次子宫内膜诊刮时间将受试者分为1年以下、1年及以上两组，分别分析首次发生子宫内膜诊刮的时间与ERα基因SNPs的关系。发现首次子宫内膜诊刮时间与rs9340799位点SNPs存在显著相关性(χ2=27.160 0，P<0.01)。同一基因型患者间比较，A/G基因型患者1年内出现内膜诊刮事件数明显多于1年以上者(χ2=4.724 0，P<0.05)，见表5。

表5 ERα基因SNPs与首次子宫内膜诊刮时间的关系 Tab.5 Relationship between SNPs of ERα gene and the time of first endometrial scraping

3 讨论

他莫昔芬及枸橼酸托瑞米芬在抑制ER阳性乳腺癌细胞生长的同时，也刺激ER阳性子宫内膜细胞增生。有研究报道[6]，乳腺癌患者手术后口服他莫昔芬引起子宫内膜息肉及子宫内膜增生的发病率分别为5%～35%及4.7%～16%，而子宫内膜癌的发病率为0.8%～5%。由此可见，SERMs对不同靶器官具有不同的作用，在乳腺肿瘤组织中发挥抗雌激素作用，而对子宫内膜则表现为弱雌激素样作用，能引起一系列子宫内膜病变。对于此类乳腺癌内分泌治疗引起的药物性子宫内膜病变，孕激素治疗的安全性仍存疑虑，因此，临床上绝大多数的患者和医生都会选择通过暂时停止内分泌治疗及刮宫来明确诊断并降低子宫内膜厚度[7]。在近10年的内分泌药物治疗过程中，许多乳腺癌患者常常需经历数次的刮宫治疗，有创性操作严重影响患者内分泌治疗的依从性。

然而并不是每一例服用SERMs药物的乳腺癌患者均会发生子宫内膜病变，即使发生内膜病变，在内分泌药物使用时间相同的情况下，患者内膜增厚及病变的程度也差异巨大。早期将这种情况的解释归于个体对于内分泌调节功能的差异，近年来，遗传因素受到人们的重视和认可。雌激素主要通过与α受体结合发挥作用，ERα的基因多态性可以改变雌激素受体的表达水平及功能，从而影响雌激素的生物学效应。本研究探索他莫昔芬或枸橼酸托瑞米芬内分泌治疗(>1年)的乳腺癌患者ERα基因 rs9340799、rs2234693位点 SNPs 与药物引起的子宫内膜病变的相关性，研究结果发现，ERα基因rs9340799位点3个亚型(A/A、A/G、G/G)患者的子宫内膜厚度值及阴道诊刮比例比较均差异有统计学意义(P<0.05)。其中，A/G基因型患者子宫内膜平均厚度和阴道诊刮比例均高于A/A及G/G基因型患者(P<0.05)。而ERα基因rs2234693位点的3个基因亚型(T/T、C/T、C/C)患者的子宫内膜厚度及阴道诊刮比例均差异无统计学意义(P>0.05)。进一步本研究还发现，他莫昔芬和枸橼酸托瑞米芬两种不同的SERMs药物所引起的子宫内膜增厚及阴道诊刮比例并无明显差异。但是，在接受枸橼酸托瑞米芬治疗的受试者中，子宫内膜厚度与 rs9340799位点SNPs存在相关性(P<0.05)。且无论是他莫昔芬组还是枸橼酸托瑞米芬组，rs9340799 位点SNPs与内膜诊刮数均呈显著相关性(P<0.01)。可见，ERα基因rs9340799位点A/G亚型患者时子宫内膜病变的高发人群。此外，还发现首次子宫内膜诊刮时间与rs9340799位点SNPs存在显著相关性(P<0.01)。同一基因型患者间比较，A/G基因型患者1年内出现内膜诊刮事件数明显多于1年以上者(P<0.05)。由此可见，他莫昔芬和枸橼酸托瑞米芬引起的子宫内膜病变基本相同，因此，临床上当患者出现子宫内膜增厚的情况时，进行两种药物间的更换意义不大。而携带有子宫内膜病变易感型基因——A/G基因的患者，其子宫内膜事件发生时间较早(多在1年内)，临床可以针对该部分患者进行中医药的预防干预，或者提前予以卵巢去势。

既往研究主要集中于自然内分泌失调导致雌激素水平异常的女性人群[3，8]，鲜少涉及药物引起雌激素水平改变所致的子宫内膜病变与ERα基因多态性的关系，它与自然雌激素水平改变所导致的子宫内膜病变是否存在差异也无从考证。本研究发现，ERα基因rs9340799位点A/G亚型患者是SERMs药物引起子宫内膜病变的高发人群。但与GEORGOPOULOS等[9]的研究结果不一致。进一步查阅文献发现，针对不同人群开展的研究，其结果也存在诸多不一致[3]。分析原因，主要考虑由于人种及地区的差异导致的雌激素受体基因表达呈现明显的差异。所以本研究将目标人群限定为长期生活在长三角地区的无亲缘关系的乳腺癌患者，从一定程度上规避了因人种、地区差异引起的基因改变。但在整个研究过程中，有32例患者月经不定期，甚至长期不来潮，行妇科B超检查的时间较难把握，可能造成子宫内膜厚度检测的偏差。由于本次研究所收集的病例数较少，不适合进行分层分析，下一步研究中，将扩大样本量，按月经情况进行分层分析，将进一步消除由于妇科B超检测时间造成的误差。