费 凡，王雨萌，韩 冰

口腔鳞状细胞癌(oral squamous carcinoma cancer，OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤[1]。OSCC患者由于缺乏对该疾病的认识以及患者自身经济、心理等因素的影响，多数患者就诊时已为晚期，超过50%的OSCC患者出现颈淋巴结转移，这是导致OSCC患者预后不良的最常见因素之一[2-3]。未发生区域性淋巴结转移的OSCC患者其五年生存率大约为80%；但当涉及颈淋巴结转移时，五年生存率降至40%；而出现远处转移者生存率则低至20%[4]。因此，提高OSCC患者生存率及改善预后的关键在于疾病的早期诊断和治疗。

外泌体(exosome)是由多种类型的细胞分泌的一种具有脂质双层膜结构的细胞外囊泡，具有其源细胞的生物学特性，其内容物主要包括蛋白质、DNA片段、RNA、细胞因子等，外泌体参与许多重要的生理病理过程，包括重塑肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)、调节免疫细胞功能、促进肿瘤发生发展及转移等多个方面。此外，肿瘤细胞衍生的外泌体内含的特异性成分使其在肿瘤生物标志物方面也有应用潜力。本文对外泌体在OSCC的发生发展、侵袭转移及化疗耐药等方面的研究进展进行综述。

1 外泌体概述

外泌体是被脂质双层包裹的纳米级细胞外囊泡，直径范围为40～100 nm，它们在吞噬内体后形成携带腔内囊泡的多囊泡体。外泌体可由不同类型的细胞释放，例如肠上皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、脂肪细胞，最重要的是肿瘤细胞。一经释放后，外泌体可与靶细胞的质膜融合在一起，从而将内容物释放到细胞质内或成为内体并遵循内吞途径，在靶向细胞的基础上，外泌体可通过巨胞饮作用、受体介导的内吞作用或吞噬作用穿过细胞质膜，从而进行细胞间的膜物质交换、细胞间通信、传递细胞信号、改变基因的表达以及调控靶细胞的整体功能[5]。研究证实，外泌体可以将蛋白质、DNA、mRNA以及非编码RNA等生物活性分子在细胞间传递，在肿瘤的发生发展、侵袭、转移及耐药中发挥作用[6]。由于外泌体是由内体形成的，所以转运膜受体、热休克蛋白、磷脂酶、核酸、脂质以及源自起源细胞的蛋白质，这些特征使这些纳米颗粒在肿瘤诊断时成为极好的生物标志物。此外，外泌体可以作为信号通路，直接改变肿瘤细胞的侵袭能力，并启动上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，也可以改变周围和远处非肿瘤细胞的生理状态，使肿瘤细胞得以传播。循环肿瘤来源的外泌体可通过转运促进侵袭转移的蛋白质和miRNA来影响细胞信号传导和肿瘤微环境[7]。

2 外泌体与OSCC的发生发展

机体细胞分泌的外泌体可以携带各种分子，其中一些成分具有致癌作用，例如肿瘤蛋白、致癌转录因子、致癌miRNAs等，这些分子进入受体细胞后能够启动肿瘤的发生。同时肿瘤细胞又能分泌大量的外泌体，这些外泌体通过自分泌或旁分泌方式转运维持肿瘤生长所需的因子，介导肿瘤与周围基质组织之间的沟通，促进血管生成和细胞增殖相关通路的活化以及转移前生态位的形成，从而最终促进肿瘤的进展[8-10]。研究发现，OSCC细胞能够通过自身外泌体的分泌和摄取促进肿瘤的进展，该过程受到肝素的调控。硫酸肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycans,HSPGs)是肿瘤细胞来源外泌体的膜受体，而肝素是依赖于HSPGs共受体的细胞表面受体的竞争性抑制剂，在肝素的存在下，OSCC细胞对外泌体的摄取受到抑制，从而阻止肿瘤的进展[11]。Razzo[12]的研究证实，单次静脉注射肿瘤来源的外泌体足以使携带OSCC癌前病变的小鼠肿瘤进展加速，同时减少免疫细胞向肿瘤的迁移。

2.1 外泌体参与肿瘤微环境形成

OSCC具有由多种肿瘤细胞和多种基质细胞(如成纤维细胞、内皮细胞、周细胞、免疫细胞等)组成的复杂微环境[13]。肿瘤细胞与肿瘤微环境组分之间的主要通信方式是通过分泌外泌体来实现的[14]。Jiang等[15]发现OSCC细胞能向邻近的正常成纤维细胞分泌含有p-ERK1/2的外泌体，直接激活ERK1/2信号通路并下调小窝蛋白(caveolin-1, CAV1)的表达，上调正常成纤维细胞中MCT4/PDK1的表达。这种调节在体内和体外都有发生，正因为如此，成纤维细胞分泌更多的乳酸，OSCC细胞摄取它们产生的乳酸，从而激活肿瘤细胞和活化的成纤维细胞之间的MCT4/MCT1轴，最终为肿瘤细胞的生长和繁殖提供更多的能量。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast, CAF)是TME重要的组成部分，与OSCC的进展关系密切[16]。Chen等[17]将肿瘤干细胞来源的外泌体(cancer stem cell-derived extracellular vesicles, CSC-EVs)和人正常牙龈成纤维细胞(normal gingival fibroblasts, NGFs)共培养，发现NGFs表达了明显高水平的CAF标志物，即α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。此外，CSC-EVs转化的NGFs向培养基中分泌了大量的TGF-β1。由此得出，CSC-EVs促进NGFs向CAF转化，进一步研究观察到与亲代细胞相比，在与CAF共培养后，CAL27和SCC-15细胞生成肿瘤球的能力增强。Li等[18]研究发现OSCC中的CAF衍生外泌体中的miR-34a-5通过AKT/GSK-3β/β-catenin信号级联通路促进OSCC细胞的增殖和转移。

2.2 外泌体促进血管生成

肿瘤的生长离不开对氧和营养物质的吸收，细胞代谢废物的清除，而这些过程主要依赖于血管的构建[19]。因此血管的生成过程是肿瘤进展和转移扩散的基础，许多肿瘤细胞分泌的外泌体通过向TME中的基质细胞传递功能性microRNA和蛋白质来促进肿瘤血管生成[20]。de Andrade等[21]通过聚合物沉淀法和功能测定证明OSCC细胞分泌的外泌体可显著诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的迁移和血管生成。Wang等[22]在OSCC细胞系CAL27分泌的外泌体中检测到miR-210-3p，并能够将miR-210-3p转移到HUVEC中，提高了HUVEC中miR-210-3p的表达水平，通过激活PI3K/AKT信号通路促进血管形成。Dickman等[23]研究显示OSCC细胞分泌的miR-142-3p通过消除miRNA肿瘤抑制作用来促进肿瘤细胞生长，外泌体还通过将miR-142-3p释放到微环境中来促进肿瘤血管生成。

3 外泌体与OSCC的侵袭转移

3.1 外泌体诱导EMT

肿瘤细胞局部的侵袭及远处的转移都被认为与EMT有关[24]。肿瘤细胞周围健康上皮细胞内化细胞外囊泡导致EMT，将正常细胞转变为纺锤形细胞，促进肿瘤环境内细胞的迁移和侵袭[25]。CAF在肿瘤的恶性进展中发挥着重要的作用，包括促进EMT和上皮间充质转化转移[26]。Sun等[27]证明CAF来源的外泌体将miR-382-5p转运至OSCC细胞，促进了肿瘤细胞的迁移和侵袭。Li等[28]发现，缺氧微环境刺激OSCC细胞产生富含miR-21的外泌体，这些富含miR-21的肿瘤细胞来源的外泌体可分布到常氧区域，进一步研究发现，miR-21的过表达显著增加了波形蛋白和SNAIL的表达并下调了E-钙粘着蛋白的表达，诱导EMT发生，最终促进了体外OSCC细胞迁移和侵袭，并在异种移植小鼠模型中诱导肿瘤生长和转移。OSCC细胞中含有EGFR的外泌体能够将正常上皮细胞以旁分泌方式转化为间充质表型[29]。近期有研究者发现，一种新的长链非编码RNA TIRY在CAF来源的外泌体中过表达时激活了Wnt/β-catenin信号通路，下调miR-14的表达，使EMT标志物表达增加，包括转录因子(SNAIL和FOXC2)和细胞骨架蛋白(α-SMA、β-catenin和FSP1)从而增强OSCC的侵袭和转移[30]。

3.2 外泌体与免疫抑制

肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAM)促进肿瘤的进展和转移，并与不良预后相关。TAM是肿瘤炎症微环境的关键驱动因素，有助于肿瘤细胞的存活和侵袭，诱导血管生成和阻断抗肿瘤免疫反应[31]。Cai等[32]通过OSCC细胞衍生的外泌体与巨噬细胞共培养实验发现，来源于OSCC细胞的外泌体将miR-29a-3p传递到巨噬细胞，诱导巨噬细胞向与肿瘤形成相关的M2亚型极化，共培养的培养基促进SCC-9和CAL-27细胞的增殖和侵袭。进一步研究发现，外泌体包裹的miR-29a-3p介导巨噬细胞极化的机制是促进了巨噬细胞中细胞因子信号抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)和转录激活因子6(signal transduction and transcriptional activator 6，STAT6)信号通路的活化。M2型巨噬细胞产生白细胞介素-10和精氨酸酶-1等免疫抑制性细胞因子来阻断抗肿瘤免疫，并在许多癌症如胰腺癌和OSCC中表达高水平的程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)，从而触发T细胞的检查点阻断并对肿瘤细胞产生免疫抑制作用[33-35]。Pang等[36]研究发现，OSCC细胞分泌的外泌体将CMTM6转运至巨噬细胞，并通过激活ERK1/2信号通路诱导M2样巨噬细胞极化，促进OSCC的侵袭及转移。有报道称，OSCC的血浆外泌体通过下调NK细胞中NKG2D的表达而抑制免疫系统。在活动性疾病患者中，血浆外泌体通过增加CD8+T细胞的凋亡，抑制CD4+T细胞的增殖，促进Treg细胞的产生，更有效地建立免疫抑制微环境[37]。这些发现表明来自OSCC的外泌体可能通过抑制免疫细胞的抗肿瘤作用参与了OSCC的侵袭。

4 外泌体与OSCC的预后

由于OSCC早期检测的困难，大多数患者在就诊时已有颈部淋巴结或远处转移。早期发现及治疗对于降低死亡率和改善预后至关重要，因此，对于OSCC诊断和预后的生物标志物的早期检测需求很高。Rabinowits[38]对舌鳞状细胞癌患者的良、恶性组织和血浆中microRNA的表达进行了比较分析，在总共359个miRNA中，有16个在成对肿瘤和良性组织中差异表达。研究者发现，OSCC患者的循环外泌体miR-21的水平与T分期及淋巴结转移密切相关[28]。Wang等[39]发现层粘连蛋白-332在有淋巴结转移的OSCC患者血浆外泌体中高表达。Luo等[40]的研究显示循环外泌体circ_0000199的高表达与咀嚼槟榔、肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期显著相关，此外高水平外泌体circ_0000199患者的肿瘤复发率及死亡率均高于低水平外泌体circ_0000199患者。综上所述，外泌体在OSCC的早期诊断方面具有极大的应用潜力，并且可能成为OSCC的生物标志物。

5 外泌体与OSCC化疗耐药

化学疗法是OSCC常见的治疗方法，为癌症晚期患者带来许多益处，包括肿瘤的缩小、远处转移的减少以及预后的改善[41]。许多研究表明外泌体在肿瘤耐药性形成中发挥重要作用。顺铂是治疗OSCC患者的一线化疗药物，但目前顺铂的耐药仍然是影响其临床疗效及应用的主要障碍[42]。Kulkarni[43]通过体外实验观察到顺铂耐药的OSCC细胞中miR-30a表达较顺铂敏感细胞下降，进一步研究发现外泌体介导的miR-30a在顺铂耐药的OSCC细胞中通过Beclin1降低自噬反应，同时抑制Bcl2促进细胞凋亡，从而恢复OSCC细胞顺铂敏感性。Liu等[44]研究发现，源自顺铂耐药OSCC细胞的外泌体可以将miR-21转移至OSCC亲代细胞，并通过靶向磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)以及程序性细胞死亡4(programmed cell death 4，PDCD4)增强了顺铂的化疗耐药性并降低了DNA损伤信号。Wang等[45]研究发现过表达锌指蛋白反义链-1(zinc finger antisense 1，ZFAS1)可以抑制OSCC细胞对顺铂的敏感性，促进OSCC细胞生长，进一步从顺铂敏感和顺铂耐药的OSCC患者血清中提取外泌体进行实时荧光定量多聚酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)，研究结果显示顺铂耐药OSCC患者的血清外泌体中ZFAS1上调。

6 总结与展望

外泌体参与了OSCC的发生发展、侵袭转移、化疗耐药等多个方面，由于其内包含不同的成分，能够反映来源细胞的某些特性，故可用作OSCC的潜在生物标志物。目前关于外泌体的检测标准和分离方法尚未完全统一，外泌体的生物安全性也是有待解决的问题。这方面的进一步研究，如临床研究或大型动物模型研究仍然需要证明外泌体在治疗中的安全性，尤其是从肿瘤细胞中分泌的外泌体。尽管面临着巨大的挑战和困难，外泌体仍然在OSCC治疗和早期诊断中富有巨大的潜力，需进一步更全面地研究外泌体调控OSCC发生发展的内在机制，以期为OSCC的治疗提供机会。