马睿婷 于利国 郑兰兵

(内蒙古自治区精神卫生中心，内蒙古 呼和浩特 010010)

艾司西酞普兰于2002年获FDA批准在美国上市，2006年进入我国精神科市场，对重度的抑郁症和焦虑症有显著疗效，受到精神科临床医生的关注，迅速成为抗抑郁的首选药物之一[1]。艾司西酞普兰虽疗效好，但由于治疗窗窄，患者的个体差异也较大，抗抑郁作用与患者血药浓度显著相关[2-4]。低于有效血药浓度值的患者可能无法起到治疗作用，而超过有效血药浓度会产生口干、恶心、嗜睡、出汗增多、头痛、癫痫或激素紊乱等副作用[5-8]。目前测定艾司西酞普兰浓度的方法较多，柱切换高效液相色谱法[9]采用在线聚焦样品，克服样品转移过程中的非正态损失，样品同向转移传输，进入液相色谱以进行血药浓度的检测。均相酶免法(HEI)是一种具有酶特异性的方法，用高特异性和强催化活力的酶来测定人体液中微量的药物及内源性物质。本文通过对柱切换高效液相色谱法和均相酶免法[10，11]测定人血清中艾司西酞普兰方法的研究，对比分析两种方法的差异及影响，为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

日本岛津高效液相色谱(LC-20AT含consence数据处理系统，日本岛津公司)；台式离心机(TGL-16 CENCE，湖南湘仪离心机仪器有限公司)；电子天平(AUW120D,日本岛津)；漩涡混合器(VORTEX-5 KYLINBELL，北京中西远大科技有限公司)；全自动生化分析仪。艾司西酞普兰对照品(批号：20191001)；艾司西酞普兰质控品(批号：20191011)；艾司西酞普兰定标液(批号：20191021)；艾司西酞普兰试剂(批号：20191031)；甲醇、乙腈为色谱纯。

1.2 标本资料

来自2018年1—12月本院住院和门诊患者的艾司西酞普兰检测标本，共60份。将分离血清分为2份。

1.3 方法

1.3.1 柱切换-高效液相色谱法(Column-switching, CS)

在线柱切换HPLC检测血清中药物的浓度，Column-switching的基础结构见图1。图1a中，六通阀(6-port valve)位置A时，全血离心后，血清样品直接进样Auto-sampler，混合流动相C携带样品进入系统，稀释后的样品由D相稀释后带入MAYI Column，吸附血清中的药物分子，大分子蛋白质由废液流出，切换六通阀，切换后如图1中的b图，混合流动相AB，反相洗脱MAYI柱，将保留在MAYI柱上的药物洗脱下来，Column-C18分离，检测器检测。

(a)

1.3.1.1 专属性实验

在优选后的色谱条件下，分别对艾司西酞普兰对照品、艾司西酞普兰样品血清、空白血清进行测定，得到专属特征峰，确定艾司西酞普兰保留时间为8.0 min，空白血清无此峰。

1.3.1.2 标准曲线的制备

标准溶液制备：精密称取ES对照品1 mg，用5 mL 70%甲醇溶解，稀释至刻度，定容于10 mL量瓶，得0.1 mg·mL-1的艾司西酞普兰对照品溶液。

空白血清采自健康体检人员，混合血清各450 uL，精密加入配好的ES标准曲线溶液0.1，0.2,0.4,0.8,1.6 μg·mL-1艾司西酞普兰标准溶液50 μL，配制浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg·mL-1的梯度标准溶液。取空白血清样品500 ul，置10 mL具塞试管中，5 000 r·min-1离心5 min，取上清液备用。取20 uL进样，取柱切换色谱条件下测定峰面积，绘制标准曲线。曲线表明：艾司西酞普兰浓度为0.01～0.16 μg·mL-1时，峰面积与ES血清浓度呈有良好的线性，方程式:y=2 147.607x-9.142 46，r=0.999 4，最低检测限(S/N=3)为3.2 ng·mL-1。

1.3.1.3 精密度

配制0.1、0.4、1.6 μg·mL-1三个梯度浓度的艾司西酞普兰标准质量控制5份并进行处理，按照“1.3.1”项下色谱法进样，在1日平行测5次，精密度日内RSD为2.3%，表明精密度良好。

1.3.1.4 重复性

精密配置0.4 μg·mL-1艾司西酞普5份空白血清样品，按照“1.3.1”项下色谱法进样，采用Column-switching分析，RSD为1.7%，表明该法重复性良好。

1.3.1.5 稳定性

配制含有1.6 μg·mL-1浓度的艾司西酞普兰标准血清样品，按照“1.3.1”项下色谱法进样，于固定时间点测定(0、2、4、8、12、24h)。

1.3.1.6 方法回收率

配制2、8、12 μg·mL-1三个浓度水平的艾司西酞普兰自配标准血清样品，各浓度加入已配舒乐安定标准溶液适量，按照“1.3.1”项下色谱法进样，测定，得回收率即实际含量/理论加入含量，艾司西酞普兰血清加样回收率，结果见表1。结果显示，加样回收率在80.2%～83.7%之间，回收率符合《中国药典》关于生物样品的测定要求，表明该法准确可靠。

1.3.2 均相酶免法

均相酶免法整个反应发生在一个液相均相体系中，酶免反应萄糖六磷酸脱氢酶-艾司西酞普兰偶联物和血浆蛋白中抗艾司西酞普兰特异性抗体位点上。样本中游离的艾司西酞普兰越多，竞争性位点越多，抗体释放出的酶标偶联物就越多。游离出来的艾司西酞普兰酶标偶联物催化β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(NAD+)转化为还原型NADH，样本中的艾司西酞普兰浓度与NADH的生成量成正比，通过生化仪器紫外检测器测得其340 nm处的吸光值的变化即可计算出艾司西酞普兰的含量。

1.3.3 分析与统计

分析柱切换-HPLC法和HEI发测定结果的差异。

2 结果

2.1 血药浓度测定结果

对门诊60例服用艾司西酞普兰的患者进行血药浓度监测，单药服用，其中男19例，女41例，年龄15～75岁。对同一样本在同一天分别采用柱切换-HPLC法和HEI法进行对比测定。HEI法采用贝克曼AU-5800进行测定，柱切换-HPLC按照“1.3.1”项下方法进行测定，测定结果见表1。

表1 60例患者艾司西酞普兰血药浓度测定结果对比

从表1中可以看出，监测结果在有效血药浓度范围内占43.33%，3例患者出现轻微的副反应，但是仍然有一部分患者的检测结果不在有效范围内。根据我们对精神科药物的长期监测经验，当患者血药浓度控制在有效血药浓度范围，症状控制较好，而低于或高于有效血药浓度的患者，抑郁症时好时坏，容易反复发作。

2.2 两种方法检测的相关性评价

以均相酶免法测定的结果为Y，以柱切换-高效液相色谱法测定结果为X，进行线性回归，方程为：Y=0.921 9X+0.050 1(n=60,r=0.899 9)；将均相酶免法测定结果和柱切换-高效液相色谱法测定结果进行T检验，其结果在统计学上无差异(P>0.05)。经过比对差异不显著，但是均相酶免法测定的结果相对于柱切换-高效液相色谱法相对较低，究其原因为，均相酶免法在试剂的准备中需要温度的控制，酶的活性温度为37 ℃，所以在试剂进入机器检测前，试剂的准备尤为重要，而且均相酶免法需要生化仪器设备来完成，定标和质控的价格昂贵，有效期限短。相反，柱切换-高效液相色谱法测定艾司西酞普兰的血药浓度操作简单，也无需对血清进行预处理，试剂成本低，方法稳定，检测器本身能够实现对样本中药物小分子的检测，故能满足检验科日常监测工作。

3 讨论

本研究采用柱切换HPLC法测定人血浆中艾司西酞普兰的血药浓度，该法具有很高的灵敏度和专属性。均相酶免法测定的艾司西酞普兰的血药浓度是葡萄糖六磷酸脱氢酶-艾司西酞普兰偶联物抗体位点竞争性结合的产物，酶的活性、底物的活性都会影响检测结果，具有很高的特异性。柱切换-HPLC系统检测血药浓度在线聚集样品，减少样品前处理的损失，样品进入液相采用柱切换技术同向处理除去蛋白，可以防止分析柱的堵塞，从而具备良好的耐受性及可定量性，样品处理简单、结果准确度高和自动化程度高等，该技术适用于精神科药物的血药浓度监测[5-7]。

均相酶免分析方法借助生化分析仪，其测定速度快、测定结果准确、测定过程和柱切换高效液相法一样不需前处理血清样品，经过定标、质控后，2 min内即可出结果，试剂具有一定的稳定性，操作过程简便，数据处理过程已经量化，无需计算[8,9]。但是HEI方法灵敏度对于有些药物不能够准确检测，测定时定标、质控都对样品温度和检测温度有一定的要求，反应终点难于严格要求，同时均项酶免法对于精神科药物的血药浓度检测试剂价格昂贵，检测成本过高，不利于临床检验，有待进一步改进[12-15]。

两种方法检测艾司西酞普兰血药浓度的检测结果均可为临床提供可靠的检测结果，艾司西酞普兰差异直接影响临床医师的用药和个体治疗，两者检测结果相近，对检测结果有验证的作用，在临床应用中柱切换高效液相色谱法特异性和专一性强，较HEI法实用性强一点，能够满足艾司西酞普兰的临床检测。患者在一个用药周期内监测艾司西酞普兰血药浓度应采用同一种方法，以便为临床提供精准的个体检测结果。