叶磊海，叶佳明，裘钧陶，钟世欢，黄 南，詹越城，何 斌，王庆玲

（1.浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310009；2.赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310009）

激素是一类调节机体代谢，协调机体器官系统之间活动并维持内环境稳定的物质，主要包括糖皮质激素，性激素和孕激素[1]。近些年来，其快速高效的治疗效果诱使人们不但将其用于动物疾病的治疗，而且添加到动物饲料或饮用水中用于非治疗性的防病和促生长，提高蛋白转化率，改善畜产品品质，在动物养殖行业中非法使用[2]，研究表明，某些激素可长期在动物体内中残留，过量摄入后会对人体正常激素平衡造成干扰，引起体内分泌功能紊乱，抑制机体的免疫功能，诱发感染，甚至有致癌风险[3]。因此，欧盟、美国食品药物管理局严格规定禁止在动物源性食品使用激素类药物[4]，我国农业部250号公告[5]也明确规定禁止在动物性食品中检出甲基睾丸酮与群勃龙等激素类药物。食品中兽药最大残留限量国家标准中也对部分药物进行了限量规定，比如倍他米松在动物肌肉中限量 0.75 μg/kg，地塞米松 1.0 μg/kg[6]。

目前国内外检测激素药物的方法[7]主要有气相色谱质谱法（GC-MS）[8]、高效液相色谱法（LC）[9]和液相色谱质谱串联法（LC-MS）[10-11]。其中；GC-MS方法样品需要衍生化，前处理繁琐，有的激素也不容易通过衍生得到很好的极性和稳定性，制约了其在多残留分析中的应用[12-14]；LC由于检测器的局限性，定性能力差，难以应用于多组分的的筛查和确证；LC-MS由于具有高灵敏和高选择性的特点，被广泛应用在兽药，农残的检测工作。目前以四极杆飞行时间质谱（Q-TOF/MS）[15-16]等为代表的高分辨质谱技术为多组分药物残留的筛查带来了新的手段，其具有高质量准确度、高质量分辨率，可提供全面的定性和定量信息等优点，通过精确质量数的自动检索匹配以及二级特征碎片离子的确定，来实现复杂基质中痕量组分的高通量的筛查和确证。

QuEChERS作为一种常用的分散固相萃取技术被越来越多应用到高通量药物筛查工作中，一些传统的吸附剂如：十八烷基键合硅胶（C18），N-丙基乙二胺（PSA），石墨碳黑（GCB），中性氧化铝（Alu-N），其中PSA和GCB能吸附基质中的糖类和色素，C18和Alu-N具有良好除脂能力，但是针对性较差，在去掉基质干扰物的同时也会吸附目标物。已有研究表明，一些新的材料凭借其某些特殊的性能被用来作为新型吸附剂用于农残，抗生素和激素多残留的检测[17]。其中增强型脂质去除吸附剂（EMR）作为一种新型的吸附剂，采用特殊聚合物基质专门吸附脂质中C5及以上的碳链，对脂质具有非常强的选择吸附性，官能化聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP-2）吸附剂，其表面键合有吡咯烷酮和微量的脲基官能团，具有富于电荷的表面结构，可以吸附大多数高极性化合物。

测定激素药物的前处理方法主要有液液萃取法[18]、固相萃取法[19]、QuEChERS（quick, easy,cheap, effective, rugged and safe)法[20]。液液萃取法要使用大量的有机试剂且步骤繁琐，固相萃取法虽然净化效果好，但使用的萃取小柱成本过高，QuEChERS早期应用于农药残留的检测，随着不同种类的新型吸附剂的开发，近年来也逐渐在测定激素工作中得到应用。本研究以常用32种激素为研究对象，旨在建立一种高效液相色谱一四极杆飞行时间质谱（LC-Q-TOF/MS）同时测定动物组织32种激素残留的快速筛查和定量方法。方法拟用增强型脂质去除剂（EMR），N-丙基乙二胺（PSA）和官能化聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP-2）等吸附剂代替传统的吸附材料，以解决传统QuEChERS所用的吸附剂在除脂和目标物共吸附的矛盾，以期为此类物质的检测提供更多的技术选择。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

32种标准物质 纯度均大于95.0%，德国Dr.Ehrenstorfer，具体信息见表1；乙腈、甲酸、甲醇 色谱纯，美国J.T.Baker；氯化钠、硫酸镁 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；增强型脂质去除吸附剂（EMR） 美国 Agilent公司；十八烷基键合硅胶C18、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳黑（CCB）、中性氧化铝（Al-N）、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP-2）吸附剂 天津博纳艾杰尔公司；实验用水 Millipore-iQ高纯水净化仪制得；牛肉、鸡肉、猪肝 均采自农贸市场，均质后-18 ℃保存待用。

表1 32种激素质谱筛查参数Table 1 Screening parameters of 32 hormones by mass spectrometry

Agilent 1290高效液相色谱-6545四极杆飞行时间质谱联用仪 美国Agilent公司；SOP万分之一电子分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司；HS260旋涡振荡器 德国IKA公司；N-EVAPl l 2水浴式氮吹仪 美国Organomation公司；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 准确称取5.0 g（精确到0.01 g）混合均匀的样品于50 mL离心管中，加入5 mL水，旋涡混匀30 s，准确加入乙腈15 mL，超声提取10 min，5000 r/min离心5 min，取上清液于另一离心管中，用乙酸乙酯10 mL重复提取残渣1次，合并两次上清液，加入1 g EMR吸附剂（预先加5 mL水进行活化），旋涡 30 s，然后 5000 r/min离心5 min，取全部上清液加入盐析剂（3 g无水硫酸镁和1 g氯化钠），旋涡混匀30 s，然后5000 r/min离心5 min ，取全部上层清液加入100 mgPSA和10 mg官能化聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP-2），旋涡混匀 30 s，然后 5000 r/min离心5 min，取上清液在40 ℃下用氮气吹至近干，加入 1 mL 0.1% 甲酸水-乙腈（90:10，V:V）复溶，旋涡30 s，过 0.22 μm 滤膜上机。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse Plus-C18柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流动相：A：0.1% 甲酸，B：0.1% 甲酸乙腈，梯度洗脱程序：0～3 min，10%～30% B%，3～10 min，30%～75% B%，10～13 min，75%～75% B%，13～15 min，75%～90% B%，15～16 min，90%～90% B%，16～16.1 min，90%～10% B%，16.1～20 min，10%～10% B%。流速：0.3 mL/min ，温度：30 ℃，进样量：5 μL。

1.2.3 TOF/MS条件 离子源：Dual AJS ESI源，扫描方式：正离子全扫描采集一级质谱数据，Target MS/MS模式采集二级质谱数据；扫描范围：m/z 50～700；毛细管电压：4000 V；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：12 L/min；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：10 L/min；裂解电压：150 V；飞行时间管真空度：2.05×10-7Torr；使用嘌呤（m/z 121.050873）和六磷氮（m/z 922.009798）作为参比液进行实时质量校准，质量误差精度低于5×10-6。

1.2.4 数据库的建立 用甲醇溶液分别配制各标准物质为100 μg/mL，并用50%甲醇水配制成质量浓度1.0 μg/mL 32种混合标液，为按上述仪器条件，在全扫描模式下对32种混合标液进行分析，获得化合物的精确分子质量，同位素信息和保留时间，建立一级谱库。然后在Target MS/MS模式下分析，得到不同碰撞能（10、20、40 eV）下碎片离子的质谱图，建立二级谱库，最后将两次采集的信息导入PCDL软件，完成质谱库的建立。32种激素的分子式、精确质量数、质量偏差、保留时间、子离子等质谱参数见表1。

1.3 数据处理

数据分析采用安捷伦公司的质谱定性分析数据处理软件（MassHunter Qualitative Analysis B.5.00）。样品分别在全扫描模式和Target MS/MS模式进行数据采集，通过建立好的32 种激素类化合物数据库进行化合物提取与匹配，主要通过保留时间、精确质量数、化合物同位素丰度进行定性。通过基质提取液配制标准曲线。空白样品按步骤1.2.1方法进行处理，得到空白基质，以此配制质量浓度分别为5、10、20、50、100、200、1000 μg/L 的标准溶液，LC-QTOF/MS进样测定，以各化合物的一级母离子响应峰面积对其质量浓度绘制曲线，外标法定量。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取剂的选择 对目标物的提取效果取决于样品的基质和化合物的极性，由于动物组织中基质复杂，含有蛋白质、脂肪等内源性物质，干扰目标物的分析，使得性激素多残留分析检测具有一定的难度[21-23]，试验涉及到的激素类药物属于弱极性或中等极性化合物，易溶于有机溶剂[24]。因此，本实验选取鸡肉、牛肉、猪肝作为不同类型的基质代表，以甲醇、乙腈、乙酸乙酯为提取剂考察不同提取剂的提取效果，具体见表2。结果表明，在50 μg/kg的加标水平下，三种提取剂甲醇提取效果较差，个别组分如丙酸诺龙单次提取效率只有20%～40%，乙腈和乙酸乙酯单次提取效率较高，但是在猪肝复杂基质中个别组分如孕酮，在乙腈中的提取效率要高于乙酸乙酯，而在鸡肉等简单基质中，孕酮在乙酸乙酯中的提取效率要好于乙腈。可能是由于在复杂基质中乙酸乙酯提取共萃物较多，导致更多的基质效应。因此本实验采用乙腈和乙酸乙酯分步提取的方式，能够兼顾不同基质不同组分的提取效率，两次提取后各药物平均回收率在85%以上。

表2 32种激素中不同基质中3种提取剂回收率的比较Table 2 Comparison of recovery rates of three extractants in different substrates of 32 hormones

2.1.2 净化条件的选择 本研究通过加标回收率考察了 C18、Alu-N、GCB、EMR、PSA、PEP-2这 6种吸附剂对32种激素的吸附情况。结果表明C18、Alu-N、GCB对目标化合物均有不同程度的吸附，其中C18、Alu-N对丙酸睾酮、氢化可的松等亲脂性较强的激素有明显吸附，平均回收率在80%左右，GCB因其可吸附带苯环官能团的药物，对大部分药物均有明显的吸附，平均回收率不足70%。而适量的EMR、PSA和PEP-2对化合物的吸附影响较小，回收率在90%以上，具体见图1。通过平均回收率和基质效应结果，进一步考察了不同添加量的净化效果，参考文献[25]和经验，分别比较了在100 μg/L的混合标准溶液中添加 EMR 1～5 g，PSA 100～500 mg，PEP-2 10～50 mg不同添加量的净化效果，具体见表3，结果表明：EMR不同添加量回收率和基质效应基本没有差别，PSA加入100 mg时，基质效应适中，回收率最佳，而PEP-2在加入量超过30 mg的时候，平均回收率不到75%，加入量在减少至10 mg，平均回收率在90%以上，与不加入对比，样液的澄清度和图谱上杂质峰情况有明显改善。所以本实验最终确定加入1 g EMR吸附剂，100 mg PSA，10 mg PEP-2作为最终的添加量。

表3 3种吸附剂不同加入量对32种目标物回收率的影响Table 3 Efects of different amounts of three adsorbents on the recoveries of 32 target compounds

图1 不同吸附剂对32种目标物回收率的影响Fig.1 Effect of different adsorbents on the recovery of 32 target compounds

吸附剂实验表明，基于增强型脂质吸附剂（EMR）的QuEChERS法能够解决传统吸附剂与目标物共吸附的矛盾，可以去除基质中大部分杂质，很大程度上降低了基质干扰，提高整个方法的灵敏度。

2.2 质谱和色谱条件的优化及数据库的建立

2.2.1 质谱条件优化和数据库的建立 使用Dual AJS ESI源，在m/z 50～700范围内对32种1.0 μg/mL目标化合物进行一级质谱全扫描分析，得到目标化合物的总离子色谱图，结果显示，所有药物在正离子得到的碎片信息要多于负离子模式，正离子模式下形成[M+H]+准离子峰。比较各个化合物提取离子流色谱图的响应和峰型，依次对离子源参数（毛细管电压、干燥器温度、干燥器流速、鞘气流速、鞘气温度等）进行优化，使质谱仪灵敏度达到最优，然后优化各化合物的裂解电压，使其响应值最大，其范围在120～170V，最终选择均能获得较高响应值的150 V作为本方法的裂解电压。

飞行时间质谱主要利用各化合物的筛查参数来筛查和确证目标物，本方法主要通过Agilent Mass-Hunter Qualitative Analysis（B.5.00）软件完成化合物质谱筛查参数数据库的建立。在全扫描模式下先进行一级质谱扫描，得到目标化合物的保留时间、精确分子质量、同位素信息、质量误差等相关信息，然后在Target MS/MS模式下采集得到碰撞能为10、20、40 eV各化合物的二级质谱数据，建立32种目标化合物的筛查数据库。根据欧盟2002/657/EC法案的中累计4个识别点鉴定化合物的要求，高分辨质谱母离子得到2个识别点，碎片离子得到2.5识别点。因此基于保留时间，一级母离子飞行时间质谱精确质量数、同位素丰度匹配、二级特征离子碎片等信息的飞行时间高分辨质谱具有比低分辨质谱更可靠的定性分析优势。

2.2.2 色谱条件优化 32种激素在C18色谱柱上均有较好的保留，考虑到选择的激素药物中有多种同分异构体，主要有泼尼松龙和可的松，地塞米松和倍他米松，曲安奈德、倍他米松醋酸酯、地塞米松醋酸酯和氟尼缩松，阿氯米松双丙酸酯和倍氯米松双丙酸酯，甲基泼尼松龙醋酸酯和地索奈德共5组同分异构体，给分离造成了一定的困难，根据经验和文献[26-27]，主要通过不同的色谱柱和不同的流动相及梯度洗脱体系进行了优化。本研究主要比较Extend C18、BEH C18、Eclipse Plus-C18三种色谱柱对32种激素的保留行为，结果表明目标化合物包括5组同分异构体在EclipsePlus-C18色谱柱能获得较理想的分离度。

同时，对比了甲醇水、乙腈水体系两种流动相体系，结果发现，采用甲醇-水流动相时，几种同分异构体无法有效分离，而乙腈-水体系不仅能有效分离同分异构体，而且峰型更尖锐，响应值更高，主要是因为乙腈较甲醇有更强的洗脱能力。所以，选择乙腈为有机流动相，再进一步比较不同pH的水系流动相（水、0.1%甲酸、0.2%甲酸、1%甲酸水溶液）。结果表明，在水中加入0.1%甲酸，能提高目标化合物的响应，并获得满意的分离效果，为了保持流动相体系的平衡，在乙腈中也加入0.1%甲酸。故最终选择0.1%乙腈-0.1%甲酸水作为本方法的流动相体系，EclipsePlus-C18色谱柱作为分离工具，可以兼顾32种激素药物的色谱保留行为及质谱响应，经优化后的梯度洗脱能在20 min内有效分离32种化合物。在以上条件优化后的离子色谱图2。

图2 32种激素提取离子色谱图Fig.2 High resolution extracted ion chromatogram of 32 hormones

2.3 基质效应的研究

基质效应是利用液相色谱-质谱联用分析复杂药物时影响定量准确性的重要因素[28]，共流出在离子源竞争性离子化，会导致目标物离子化效果的增强或抑制，从而表现出基质增强或者抑制现象[29-30]。本实验以猪肉为研究对象，在空白猪肉提取液中加入不同浓度的混合标液，并与空白甲醇试剂配制的标液进行比较，以Matrix Effect（ME）表示基质效应，本实验每种目标物的基质效应结果如表4所示，ME值越接近1，说明基质效应越小，反之亦然。结果表明，在优化后方法处理后，各药物的基质效应在0.725～0.913，具体见表4，说明本方法的前处理能有效降低基质效应，为了获得更准确的定量结果，本方法还是采用基质标校准曲线进行定量计算。本方法也可以通过使用内标物降低基质效应影响，但是考虑到内标物造价昂贵，很难找到满足所有药物筛查条件的内标物，因此本实验并未采用添加内标的方法。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围、回归方程、检出限和定量限 在本文确定条件下，对32种激素药物进行测定，用牛肉空白基质配制一系列浓度，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，采用标准加入法进行测定，以一级母离子响应3倍信噪比和10倍信噪比分别确定样品的检出限（LOD）和定量限（LOQ），通过表4可以看到32种药物在各自线性范围内相关系数≥0.995以上，线性相关良好，LOD范围为1～10 μg/kg，LOQ范围为 3～30 μg/kg，灵敏度满足实际检测的需要。

表4 32种激素的基质效应、回归方程、相关系数、线性范围、检出限（LOD）及定量限(LOQ)Table 4 Matrix effect, regression equation, correlation coefficient, linear range, LOD and LOQ of 32 hormones

2.4.2 方法回收率和精密度验证 选取牛肉、鸡肉、猪肝不同基质阴性样品分别添加10、50、100 μg/kg 3个不同浓度，每个浓度进行6次重复测定，考察方法回收率和精密度，从结果来看，该方法回收率在不同基质中达到70.3%～116.2%之间，相对标准偏差（RSD）为0.87%～8.97%，说明本方法具有良好的精密度和准确度。其中牛肉中加标回收率和RSD具体见表5，其他数据不一一列出。

表5 牛肉中32种激素加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 5 Recoveries and relative standard deviations of 32 hormones in beef (n=6)

续表5

2.5 实际样品的筛查

采用本方法对市售30批次鸡肉，30批次牛肉和20批次猪肝进行检测，每种样品进行双平行测定，其中检测出猪肝中地塞米松1份，鸡肉中地塞米松 1份，含量分别为 10.2、6.7 μg/kg，均超过最大残留限量1.0 μg/kg规定[6]，阳性样品用国标方法进行方法验证，测量结果非常接近。表明本方法结果可靠，可作为日常样品的筛查。

3 结论

本方法建立了基于QTOF高分辨质谱快速筛查动物组织中多种激素残留检测方法，通过乙腈和乙酸乙酯分步提取，提取剂用EMR、PSA、PEP-2分步净化，通过C18色谱柱进行分离，在全扫描模式下采集一级质谱数据，以待测物的准分子离子峰的峰面积定量，以保留时间、精确质量数、同位素丰度比等特征信息定性，并应于于市售80份实际样品的筛查分析。结果说明，该方法操作简单，回收率高，重现性好。80份样品检测出猪肝中地塞米松 1 份，鸡肉中地塞米松 1 份，含量分别为 10.2、6.7 μg/kg，均超过最大残留限量 1.0 μg/kg 规定。采用一次制备样品，可以同时快速筛查动物组织中32种激素药物，一次进样分析，可同时提供定量和定性的结果，大大提高实验室检测能力，为进一步准确筛查动物组织中激素残留提供了丰富的技术手段。