何洁 梁霜 张国俊 赵致 李忠

摘要：【目的】明確贵州省施秉县太子参叶斑病的病原种类，并探究6种杀菌剂对病原菌的室内抑制活性，以期为太子参叶斑病田间药剂防治提供参考。【方法】利用组织分离法对具有典型叶斑病症状的太子参病叶进行病原菌分离纯化，依据柯赫氏法则进行验证，结合形态学观察及多基因（ITS、tef1、LSU、SSU、GAPDH和rpb2）系统发育分析对病原菌进行鉴定;采用菌丝生长速率法测定6种常见杀菌剂（35%氟菌·戊唑醇悬浮剂、43%氟菌·肟菌酯悬浮剂、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂、60%唑醚代森联水分散粒剂、37%苯醚甲环唑水分散粒剂和30%苯甲丙环唑乳油）对病原菌的室内毒力。【结果】引起贵州省施秉县太子参叶斑病的病原菌为细极链格孢（Alteraria tenuissima），菌株编号为TZSYB1。室内毒力测定结果表明，供试6种杀菌剂对菌株TZSYB1菌丝生长均有一定的抑制作用，其中30%苯甲丙环唑乳油的抑制活性最强，对病原菌的抑制中浓度（EC50）为10.81 μg/mL;其次为37%苯醚甲环唑水分散粒和43%氟菌·肟菌酯悬浮剂，EC50分别为21.31和27.31 μg/mL。【结论】引起贵州省施秉县太子参叶斑病的病原菌为细极链格孢，可选用30%苯甲丙环唑乳油、37%苯醚甲环唑水分散粒剂和43%氟菌·肟菌酯悬浮剂进一步开展田间防治试验。

关键词： 太子参;叶斑病;病原鉴定;细极链格孢;药剂筛选

中图分类号： S435.675                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）08-2124-09

Pathogen identification and screening of fungicides against Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax leaf spot

HE Jie1， LIANG Shuang1， ZHANG Guo-jun1， ZHAO Zhi2， LI Zhong1， 2*

（1College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang  550025， China; 2Key Laboratory of Propagation

and Cultivation on Medicinal Plants in Guizhou Province， Guiyang  550025， China）

Abstract：【Objective】In order to identify the pathogen species of Pseudostellaria heterophylla（Miq.） Pax leaf spot in Shibing， Guizhou， and to explore the indoor inhibitory activity of six fungicides against the pathogen， so as to provide reference for field fungicide control. 【Method】The pathogen were isolated and purified from diseased leaves wit typical leaf spot systems by tissue isolation method， and the pathogen were verified according to Kochs rule. Combined with morphological observation and phylogenetic tree based on ITS，tef1， LSU， SSU， GAPDH and rpb2 genes， the pathogenwere identified， and the indoor toxicity of six common fungicides（35% tebuconazole·tebuconazole SC， 43% fluorobacterium·oximeryl ester SC，75% oximex·tebuconazole WG， 60% azolethenyl WG， 37% difenoconazole WG and 30% benzopropiconazole EC） to the pathogen was determined by mycelial growth rate method. 【Results】Alteraria tenuissima was the pathogen causing the leaf spot disease of P. heterophylla in Shibing， Guizhou， and the strain number was TZSYB1. The results of indoor toxicity test showed that the six fungicides had certain inhibitory effect on the mycelial growth of TZSYB1. Among them， 30% propiconazole EC had the strongest inhibitory activity with Moderate inhibitory concentration（EC50） of 10.81 μg/mL， followed by 37% difenoconazole WG， and EC50 was 21.31 μg/mL， then was 43% fluorobactam·oxime ester SC， which EC50 was 27.31% μg/mL. 【Conclusion】The pathogen of P. heterophylla leaf spot in Shibing， Guizhou is A. tenuissima. 30% propiconazole EC，  37% difenoconazole WG and 43% fluorobacilli·oxime ester SC can be selected for further field control.

Key words： Pseudostellaria heterophylla（Miq.） Pax; leaf spot disease; pathogen identification; Alteraria tenuissima; fungicide screening

Foundation item： Guizhou Science and Technology Support Plan Project（QKHZC〔2017〕2828， QKHZC〔2020〕4Y096）

0 引言

【研究意義】太子参[Pseudotellaria heterophylla（Miq.） Pax]又名孩儿参、童参、异叶假繁缕等，为石竹科孩儿参属多年生草本植物，以干燥块根入药，药性甘、微苦，具有益气健脾、生津润肺的功效（肖培根等，2002），在临床上应用已有100多年的历史（Hu et al.，2019），一般用于治疗糖尿病、免疫调节、保护心肌、抗氧化等（沈祥春等，2008;Wang et al.，2013）。20世纪70年代太子参主要以野生为主，但随着市场需求量不断增加，野生资源极度匮乏，近年来山东、福建、安徽和贵州等省已开始大面积人工栽培（陈婷等，2019;宋叶等，2019）。据统计，贵州省黔东南州太子参栽培面积达1.39万ha，主要集中在施秉县和黄平县（康传志等，2016），随着人工种植面积逐年扩大，贵州省太子参病害越发严重，目前已报道的有叶斑病、根腐病、白绢病、紫纹羽病、病毒病、霜霉病和灰霉病等（阴华海，2015），其中太子参叶斑病的发生极为普遍，发病初期表现为中央浅白色、边缘淡黄色的水渍状病斑;随后叶斑缓慢扩大成圆形灰白色小枯斑，周围黄晕;随着病斑扩大，长出黑色小点，排列成轮纹状;发病后期病斑颜色逐渐变为浅褐色或深褐色，几个小病斑合成不规则大斑，致使整张叶片干枯、腐烂，导致整株枯死并造成大面积传染（袁小坦，2006）。经调查，施秉县太子参叶斑病发生严重时田间病株率达80%以上，产量损失50%以上（龙光泉等，2013），严重影响太子参的品质和产量，给种植户造成较大的经济损失。因此，明确太子参叶斑病病原种类并开展病害室内药剂筛选，对太子参叶斑病田间防治具有重要意义。【前人研究进展】目前已报道的太子参叶斑病病原菌有茎点霉属真菌（Phoma sp.）（王宗华等，1997）、叶点霉属真菌（Phyllosticta commonsii）（温学森等，2003）、球壳孢目壳针孢属真菌（Septoria sp.）（徐宏辉，2007）和壳二孢属真菌（Ascochyta versabilis）（李树江等，2018），传统真菌主要基于营养体和子实体的形态特征进行鉴定，但营养体的形成常受到培养条件的影响而产生较大差异，仅基于形态学已不能明确病原真菌的分类地位，因此大多倾向于使用DNA序列来进行界定，并且意识到单个基因鉴定的局限性，目前多采用多个基因联合鉴定的方法对病原真菌进行鉴定（周游，2015），如王梦奇等（2019）利用ITS、ACT、tub2、rpb2、TEF和LSU 6个基因序列对大豆茎点霉属叶斑病病原菌进行准确鉴定。目前对于太子参叶斑病病害防治主要以化学药剂防治为主，据报道用于防治由壳针孢属真菌引发的太子参叶斑病的药剂有代森锌、60%多菌灵和70%甲基托布津等（温学森等，2003），在太子参叶斑病发病期进行叶面喷施能有效降低叶斑病的发生;用于防治由P. commonsii引起的太子参叶斑病药剂有70%代森锰锌、70%甲基硫菌灵和50%多菌灵等，其600和800倍液对菌丝的抑菌率均为100%（邵昌余等，2016）;对于太子参叶斑病新纪录种A. versabilis，李树江等（2018）选用5种药剂对该病原菌进行室内毒力测定，结果表明，70%甲基硫菌灵可湿性粉剂2000倍、37%苯醚甲环唑可湿性粉剂2000倍和40%氟硅唑乳油2000倍对该病原菌的抑制率均高于90%。【本研究切入点】本课题组前期研究发现，引起贵州省施秉县太子参叶斑病的病原菌与现有报道存在差异，需进一步开展鉴定及防治药剂筛选工作。【拟解决的关键问题】采用组织分离法对太子参叶斑病病原菌进行分离纯化，通过柯赫氏法则进行验证，结合形态学观察及多基因系统发育分析对病原菌进行鉴定，并测定病原菌对6种杀菌剂的室内毒力，以期为太子参叶斑病田间病害识别及药剂防治提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 病样采集 2018年5月从贵州省黔东南州施秉县太子参种植基地采集具有典型叶斑病症状的病叶，带回实验室于4 ℃冰箱冷藏备用。

1. 1. 2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g，蒸馏水补足至1000 mL。

1. 1. 3 供试药剂 35%氟菌·戊唑醇（露娜润）悬浮剂、43%氟菌·肟菌酯（露娜森）悬浮剂和75%肟菌·戊唑醇（拿敌稳）水分散粒剂（拜耳股份公司）;60%唑醚代森联水分散粒剂（巴斯夫欧洲公司）;37%苯醚甲环唑水分散粒剂（武汉楚强生物科技有限公司）;30%苯甲丙环唑乳油（东莞市瑞德丰生物科技有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 病原菌分离纯化 采用组织分离法（方中达，2007）分离病原菌。在太子参叶片病健交界处用无菌接种刀切取5 mm×5 mm的组织块，在75%酒精中浸泡10 s后于0.1%酸性升汞溶液中浸泡3 min，无菌水冲洗3次后用无菌吸水纸吸干，将其摆放于PDA培养基平板上，每个平板放置3～5个组织块，置于28 ℃、相对湿度70%、光周期12 h/12 h的培养箱内恒温培养3～5 d，挑取无污染的边缘菌丝至另一PDA培养基平板上培养7～10 d，将获得的纯培养菌株于4 ℃斜面保存备用。

1. 2. 2 致病性测定 按柯赫氏法则进行致病性测定。选取健康太子参叶片，以无菌水冲洗后用无菌滤纸擦干。采用刺伤接种和无伤接种2种方法接种病原菌：用直径为5 mm的无菌打孔器在培养7 d左右的叶斑病病原菌菌落边缘打取菌饼，用灭菌针在太子参叶片上刺伤2个点，每点接种1块菌饼，以相同方法接种菌饼于未刺伤的太子参叶片上，以接种琼脂块为对照，每处理3个重复，置于28 ℃、相对湿度70%、光周期12 h/12 h的培养箱内恒温培养，观察并记录发病情况（宋莉莎等，2019）。待叶片有明显发病特征时，再次从该叶片上利用组织分离法分离纯化病原菌，观察与原病原菌的菌落形态是否一致。

1. 2. 3 病原菌形态学鉴定 将纯化菌株接种于PDA培养基上，置于28 ℃、相对湿度70%、光周期12 h/12 h的培養箱内恒温培5 d左右，观察记录菌落菌丝颜色及形态。待长出孢子后用无菌接种针挑取菌丝制备玻片，在光学显微镜下观察产孢结构、孢子形态等，测量孢子大小并拍照记录。

1. 2. 4 病原菌分子生物学鉴定 将病原菌菌株接种于PDA培养基上，28 ℃恒温培养7 d左右，用无菌接种刀刮取菌丝体于1.5 cm无菌离心管中，采用真菌DNA提取试剂盒（Biomiga Fungal gDNA Kit）提取基因组DNA。采用真菌rDNA-ITS通用引物（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，V9G：5'-TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3'）、LSU引物（LR5：5'-TTAAAAAGCTCGTAGTTGAAC-3'，LSU1Fd：5'-GRATCAGGTAGGRATACCCG-3'）、SSU引物（NS1：5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'，NS4：5'-CTTCC GTCAATTCCTTTAAG-3'）、TEF1引物（EF1-728F：5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'，EF1-986R：5'-TACTTGAAGGAACCCTTAC-3'）、RPB2引物（RPB2-5F2：5'-GGGGWGAYCAGAAGAA-3'，RPB2-7CR：5'-CCCATRGCTTGTYYRCCCAT-3'）和GAPDH引物（gpd1：5'-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3'，gpd2：5'-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3'）对菌株进行PCR扩增[引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR体系25.0 μL：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。ITS、SSU和LSU引物的扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。TEF1引物的扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。RPB2引物的扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 60 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。GAPDH引物的扩增程序：94 ℃预变性2 min;96 ℃ 60 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。反应结束后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检验，将条带清晰的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序所得的核苷酸序列在GenBank中进行同源性比对，并下载相应的模式菌株基因序列，基于最大简约法利用PAUP 4.0构建多基因系统发育进化树（任静等，2016）。

1. 2. 5 病原菌对药物敏感性测定 采用菌丝生长速率法测定病原菌对6种供试药剂的敏感性。将纯化后的病原菌接种于PDA培养基，28 ℃培养箱中培养5～7 d。用直径5 mm的无菌打孔器打取菌饼置于含药培养基上，每皿接种1块菌饼，于28 ℃、相对湿度70%、光周期12 h/12 h的培养箱内恒温培养，以含等量无菌水的PDA培养基为对照（CK）。供试药剂分别设5个浓度，每个浓度3个重复。各药剂浓度设置：35%氟菌·戊唑醇悬浮剂设4000、8000、16000、32000和64000倍液;30%苯甲丙环唑乳油和43%氟菌·肟菌酯悬浮剂分别设6000、12000、24000、48000和96000倍液;37%苯醚甲环唑水分散粒剂设2000、4000、8000、16000和32000倍液;60%唑醚代森联水分散粒剂设500、1000、2000、4000和8000倍液;75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂设3000、6000、12000、24000和48000倍液。待对照组的菌丝长满平板时，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1. 3 统计分析

利用Excel 2010、DPS 7.0和SPASS 16.0对试验数据进行处理分析，以最小二乘法求出毒力回归方程Y=aX+b，计算供试药剂对病原菌的抑制中浓度（EC50）和回归方程决定系数。

2 结果与分析

2. 1 发病症状

太子参感病初期，叶片感病部位呈现中央白色、边缘浅黄色的黄晕斑，水渍状，随着感病时间延长病斑逐渐扩大形成黄褐色的枯斑，感病后期病斑呈轮纹状（图1-C），上着生黑色小点，为其分生孢子器（图1-A和图1-B），严重时导致整株叶片枯死。

2. 2 病原菌分离结果

对采集的病样运用组织分离法进行分离，共分离出10株形态不一的菌株，分别标号为TZSYB1～ TZSYB10。

2. 3 病原菌致病性测定结果

对各菌株进行致病性测定，结果发现，接种菌株TZSYB1后太子参叶片有明显的发病症状，致病力较强，接种其他菌株太子参叶片不发病或发病不明显。进行刺伤接种菌株TZSYB1处理，接种3 d后太子参叶片开始发病，呈现近圆形的浅黄色病斑，水渍状;接种7 d时病斑逐渐扩大，颜色逐渐加深，呈深褐色（图2-A1和图2-A2）;发病10 d后病部呈现边缘浅黄色、中央深褐色的轮纹状病斑，与田间发病症状相似（图2-B1和图2-B2）;在相同条件下未刺伤接种病原菌处理，接种10 d后太子参叶片上呈现小块淡褐色的病斑（图2-C1和图2-C2）;对照叶片未发病（图2-D1和图2-D2）。从发病叶片再分离纯化得到的病原菌与接种的病原菌相同，证实该菌为太子参叶斑病的致病菌，且致病力较强。

2. 4 病原菌的形态学鉴定

在PDA培养基上初期菌落灰白色，后期颜色逐渐加深，变为深褐色或产红色色素，气生菌丝茂盛（图3-A和图3-B）;培养7 d后菌丝长满全皿;培养15～30 d后在显微镜下观察病原菌的分生孢子形态多样，呈倒梨形、棍棒形、卵形或近椭圆形，大小为13.11～47.95 μm×7.13～12.14 μm，具1～6个横膈膜和0～4个纵隔膜，隔膜处略缢缩，有的分生孢子具有短柱状喙（图3-C～图3-E）。分生孢子梗单生或簇生，长短不一，顶生分生孢子，有隔膜，前期无色，后期逐渐变为深褐色（图3-F和图3-G）。

2. 5 病原菌分子生物学鉴定结果

扩增病原菌菌株TZSYB1的ITS、tef1、LSU、SSU、GAPDH和rpb2等6个基因并测序，将获得的序列在NCBI进行BLAST比对，下载同源性较高的序列和模式菌株进行系统发育进化分析（图4），以葱叶枯葡柄霉（Stemphylium botryosum）为外群，目标菌株TZSYB1与Alteraria tenuissima聚为一支，菌株号为CBS 918.86，同源性为97%。结合形态特征和分子生物学分析结果，将导致贵州省施秉县太子参叶斑病的致病菌鉴定为细极链格孢（A. tenuissima）。

2. 6 病原菌对药物敏感性测定结果

室内药剂筛选结果（表1）表明，供试6种药剂稀释系列浓度后对病原菌菌丝生长均有一定的抑制作用，其中30%苯甲丙环唑乳油稀释6000倍液处理的抑制率最高，为80.38%，显著高于其他处理（P<0.05，下同）。室内毒力结果（表2）表明，30%苯甲丙环唑乳油的EC50为10.81 μg/mL，显著低于其他5种药剂，表明病原菌对该药剂最敏感，其次为37%苯醚甲环唑水分散粒剂、43%氟菌·肟菌酯悬浮剂和35%氟菌·戊唑醇悬浮剂，EC50分别为21.31、27.31和36.10 μg/mL，75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂和60%唑醚代森联水分散粒剂的抑制作用较差，病原菌对其敏感性相对较低，EC50分别为84.96和531.21 μg/mL。

3 讨论

目前已报道的链格孢属真菌有500多种，其中95%寄生在不同的植物上，具有寄主范围广、传播途径多、侵染力强和危害程度大等特点（曾向萍等，2018）。该属真菌主要侵染植物叶片引起经济作物、粮食作物和果蔬作物等发生黑斑病和叶斑病，如多种蔬菜叶斑病（王莹莹，2016;吴琼等，2018）、月季黑斑病（冯宝珍和李培谦，2019）、玉米小斑病（蒙成等，2019）、葡萄叶斑病（王彩霞等，2019）、菊花黑斑病（叶琪明等，2019）、三叶木通叶斑病（张铮等，2019）、茶树叶斑病（周园园等，2019）、樱桃叶斑病（刘俏等，2020）和猕猴桃褐斑病（吕蕊花等，2020）等。此外，Woody和Chu（1992）研究发现，链格孢属真菌能产生10多种不同的真菌毒素，如链格孢酚、链格吡喃酮和链格孢酸等，对哺乳动物和人类均有害。因此，学界对链格孢属真菌病害的研究十分重视，由其引发的新病害也时有报道，如Vicent等（2016）首次报道在西班牙由链格孢属真菌引起的石榴黑心病。本研究对贵州省施秉县太子参叶斑病的病原物进行了分离纯化、致病性测定、形态及ITS鉴定等工作，基于单基因并不能明确链格孢的具体分类地位，参考Woudenberg等（2015）的研究结果，SSU、LSU、ITS、gapdh、rpb2、tef1、Alt a 1、endoPG和OPA10-2等9种基因片段可用于区分链格孢属内不同种，因此本研究选用LSU、TEF1、SSU、GAPDH和RPB2等5个引物序列进行PCR扩增，通过多基因系统发育进化树分析表明菌株TZSYB1与细极链格孢同源性最高，与前人报道的太子参叶斑病病原菌有所不同，但在田间采集病害样本时发现，该病原菌引起的太子参叶斑病的发病特征与已报道的由其他病原引起的太子参叶斑病发病症状相似，可能是由不同病原菌引发的同一种病害，推测可能是不同病原菌在不同种植地区、不同环境因素及种植条件下的适应情况不一样，使得各地区的优势菌株不同。

关于细极链格孢引起病害的防治，梅桂兰（2017）研究发现，多抗霉素1500倍液和43%戊唑醇5000倍液对枣黑斑病病原菌细极链格孢均有较好的防治效果，田间防效分别为91.2%和89.5%;张铮等（2019）研究结果表明，戊唑醇、代森锰锌和异菌脲可用于防治由细极链格孢引发的三叶木通叶斑病;范文忠等（2020）研究表明，10%苯醚甲环唑可湿性粉剂、30%氟菌唑可湿性粉剂和125 g/L氟环唑悬浮剂对水蜡叶斑病病原菌菌丝的敏感性较高，EC50分别为14.36、37.91和29.86 μg/mL。本试验在前人研究的基础上选择30%苯甲丙环唑乳油、60%唑醚代森联水分散粒剂、37%苯醚甲环唑水分散粒剂和拜尔公司推出的3种新型高效杀菌剂35%氟菌·戊唑醇悬浮剂、43%氟菌·肟菌酯悬浮剂和75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂，探究其对链格孢菌的室内抑菌效果，结果表明6種药剂对细极链格孢的菌丝生长均有抑制作用，各药剂最佳稀释倍数下抑制率均在60.00%以上，其中30%苯甲丙环唑乳油6000倍液的抑制率最高，达80.38%;室内毒力测定结果表明，病原菌对30%苯甲丙环唑乳油及37%苯醚甲环唑水分散粒剂的敏感性最高，EC50分别为10.81和21.31 μg/mL，其次为43%氟菌·肟菌酯悬浮剂、35%氟菌·戊唑醇悬浮剂和75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂，因此，可选用30%苯甲丙环唑乳油、37%苯醚甲环唑水分散粒剂和43%氟菌·肟菌酯悬浮剂进一步开展田间防治试验。近几年来，太子参叶斑病发病率在贵州省中药材种植区呈逐年增加趋势，经田间调查总结可能的原因：一是由于种植年限的增加，使得病原物长期积累，病害极易发生;二是田间病株未及时清除，导致大面积传染发病;三是由于高温高湿天气适宜病原菌的生长，进而加重了病害的发生。因此，在防治过程中应将农业防治与药剂防治相结合，适时轮作、及时清理田间病株、轮换用药等手段均能有效降低叶斑病的发生率。

4 结论

引起贵州省施秉县太子参叶斑病的病原菌为细极链格孢，可选用30%苯甲丙环唑乳油、37%苯醚甲环唑水分散粒剂和43%氟菌·肟菌酯悬浮剂进一步开展田间防治试验。

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（责任编辑 麻小燕）

收稿日期：2020-09-25

基金项目：贵州省科技支撑计划项目（黔科合支撑〔2017〕2828，黔科合支撑〔2020〕4Y096）

通讯作者：李忠（1971-），https：//orcid.org/0000-0002-9072-953，博士，教授，主要從事植物病害安全防治技术研究工作，E-mail：54618046@qq.com

第一作者：何洁（1995-），https：//orcid.org/0000-0002-1703-689X，研究方向为植物病理学，E-mail：2766724200@qq.com