孙俊

摘要：为了对辽宁省近年发生的新病害——榛子叶斑病病原菌的生物学特性进行系统测定。采用已经鉴定并报道的榛子叶斑病致病菌榛叶点霉（Phyllosticta coryli）菌株分别置于设定条件下，采用十字交叉法测量菌落直径，分别测定该病原菌菌丝及分生孢子的生物学特性，对该病害的症状及病原菌形态进行描述，并对病菌的生物学特性进行系统测定。病菌菌丝生长以PSA培养基最适，能有效利用多种糖和氮源，分别以麦芽糖和甘氨酸最佳，菌丝适宜生长温度为20～25 ℃，最适pH值为7～9，光照可促进菌丝生长，菌丝致死温度61 ℃。病菌分生孢子萌发适宜温度为15～25 ℃，最适pH值为5，黑暗条件下对孢子更易萌发，分生孢子致死温度58 ℃。对病原菌菌丝和分生孢子的生物学特性系统测定结果表明，不同培养条件下，病原菌菌丝生长和分生孢子萌发均表现出明显的差异。

关键词：榛子；叶斑病；榛叶点霉；菌落直径；生长温度；生物学特性

中图分类号： S436.64文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0101-03

榛子（Corylus heterophlla Fischl）为榛科榛属木本植物的球果，别称平榛、榛、棰子等。榛子为坚果，果形似栗子，红棕色或金黄褐色，并着彩色条纹[1]，广泛分布于东北、华北及陕西、甘肃等地。榛子有“坚果之王”的美称，与扁桃、胡桃、腰果并称“四大坚果”。其坚果营养丰富，用途广泛，经济价值高，是加工各种巧克力、糖果、冰淇淋以及榛子粉和榛子乳等高级营养品的重要原料[2]，还具有消炎、防心血管疾病、增强性功能、养颜护肤、延年益寿和抗衰老的功效[3]。而随着榛子的营养价值和药用价值逐渐被人们重视，种植面积快速增加，随之而来是病害的发生严重。2011年8月，笔者在辽宁省瓦房店市炮台镇首次发现榛子叶斑病，随后在辽宁省抚顺章党基地也发现该病的发生。

榛子叶斑病由叶点霉属（Phyllosticta）真菌引起。Saccardo于1884年首次对榛子叶斑病进行记载，病原菌为榛叶点霉（Phyllosticta coryli）[4]。笔者曾对中国辽宁省新见发生的榛子叶部病害进行初步研究，并经柯赫氏法则证病，结合分离菌株的ITS序列分析，鉴定其致病菌为榛叶点霉，认为该病害为榛子叶斑病并对其进行了相关报道[5]。

园地调查发现，在榛子结果期，高温高湿条件下的榛子叶斑病的发生率显著增加。近年来，病害发生面积呈扩展趋势。榛子叶斑病菌主要危害榛子的叶片，初期在叶片正反两面均产生针尖大小的褐色斑点，随后病斑逐渐扩大，病斑直径3～9 mm，病斑边缘颜色较中间颜色稍浅。严重时叶片干枯脱落，影响产量。湿度大时，病斑上生有小黑点，即为病菌的分生孢子器（图1-A）。利用病菌孢悬液接种榛子叶片后，室温保湿， 8～10 d叶片开始表现症状，叶面出现针尖大小褪绿斑，后扩展至圆形至椭圆形褐色病斑（图1-B），表现症状与园地症状一致。

在PDA培养基中培养10 d左右，菌落呈灰白色，气生菌丝短而致密；随着培养时间的不断加长，菌落颜色逐渐变深，呈灰黑色，在菌落上产生分生孢子器。分生孢子器球形，深褐色，直径150～205 m（图2-A）。分生孢子单胞，无色，卵圆形至椭圆形，大小在（2.4～4.5） m×（1.6～2.4） m（图2-B）。

本研究针对榛子叶斑病致病菌的生物学特性进行了较为系统的测定，以便进一步为该病害的深入研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1病菌菌丝生长测定

将纯化的菌株进行活化，在试验设定条件下接种病菌单孢子，25 ℃恒温培养，10 d后采用十字交叉法测量菌落直径。每处理5次重复[6]。

1.1.1培养基试验选用PDA、PSA、OA、玉米粉培養基、水琼脂培养基、Rechard、Czapek和孟加拉红培养基。

1.1.2碳源试验供试碳源为木糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、乳糖、山梨醇，PDA为基础培养基，不同碳源等量置换葡萄糖[7]。

1.1.3氮源试验供试氮源分别选用蛋白胨、丙氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸，查氏为基础培养基，不同氮源等量置换KNO3。

1.1.4温度试验用PDA培养基，分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃不同温度下恒温培养。

1.1.5pH值试验用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将PDA培养基pH值分别调节为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。

1.1.6光照试验采用PDA平板培养基，分别置于24 h/d光照条件、12 h光照与12 h黑暗交替、24 h黑暗条件下培养。

1.2菌丝致死温度试验

将直径为4 mm的菌片移入装有10 mL无菌水的试管中，再将试管分别置于40～80 ℃（梯度为5 ℃）9个处理温度的恒温水浴锅中处理10 min（预热1 min），测得致死温度范围后，以1 ℃为梯度求得准确的致死温度。试验重复处理5次。

1.3分生孢子萌发测定

每处理重复5次，培养24 h后每次随机镜检100个孢子，统计萌发率[6]。

1.3.1温度对分生孢子萌发的影响经预备试验后，选用孢子清水萌发法，将分生孢子配成浓度适当的悬浮液，滴于载玻片上，分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃条件下培养。

1.3.2pH值对分生孢子萌发的影响用磷酸盐缓冲液将分生孢子悬浮液pH值调配为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，25 ℃恒温培养。

1.3.3光照对分生孢子萌发的影响将分生孢子悬浮液滴在载玻片上，分别置于光照、光照与黑暗交替、黑暗条件下，25 ℃ 恒温培养。

1.4分生孢子致死温度测定

清水配制孢悬液，装入试管中，置于35～60 ℃（梯度为 5 ℃）恒温水浴锅中处理10 min（预热1 min），测得致死温度范围后，以1 ℃为梯度求得准确的致死温度。

2结果与分析

2.1环境条件对病菌菌丝生长的影响

2.1.1培养基对菌丝生长的影响病菌菌丝在PSA培养基中生长最快，其次为PDA培养基；在Rechard培养基中生长速度最慢（表1）。从菌落形态和颜色看，病菌在水琼脂中稀疏且菌落呈薄透明状，在其他各培养基中均生长致密，在OA培养基、玉米粉培养基、PDA、PSA中菌落呈局部放射状沟痕。

2.1.2碳源对菌丝生长的影响病原菌可利用多种糖，在以麦芽糖为碳源的培养基上菌丝生长最快，在以木糖为碳源的培养基上生长最慢（表2）。

2.1.3氮源对菌丝生长的影响病菌在不同氮源中生长差异显著，其中尤以甘氨酸、蛋白胨最适合菌丝生长，在含精氨酸的培养基上菌丝几乎不生长（表3）。

2.1.4温度对菌丝生长的影响温度对病菌生长影响明显，菌丝在5～35 ℃范围内均能扩展，20～25 ℃为最适宜温度。低于5 ℃或高于35 ℃均不利于病菌菌丝生长（图3）。

2.1.5pH值对菌丝生长的影响菌丝生长的pH值范围为3～11，pH值3～4范围内，随pH值增高菌丝生长速度明显加快；pH值7～9时，菌落生长速度最快，为该菌最适宜生长的pH值。可见，偏碱性条件有利于菌丝生长（图4）。

2.1.6光照对菌丝生长的影响菌丝在光照条件、光暗交替条件下菌落直径分别为6.50、6.45 cm显著高于黑暗条件下的4.77 cm。说明不同光照处理对菌丝生长的影响存在一定差异，光照条件更有利于菌丝生长。

2.1.7菌丝致死温度当处理温度达61 ℃后，无菌丝生长，表明该菌菌丝致死温度为61 ℃。

2.2环境条件对分生孢子萌发的影响

2.2.1温度对孢子萌发的影响从图5可以看出，温度对分生孢子萌发的影响较大，15～25 ℃为萌发最适温度，24 h萌发率接近80%，低于10 ℃或高于30 ℃严重抑制分生孢子的萌发。

2.2.2pH值对孢子萌发的影响病菌分生孢子萌发的pH值范围为3～11，最适pH值为5。pH值3、11时，病菌分生孢子萌发率极低（图6）。

2.2.3光照对孢子萌发的影响黑暗条件下孢子萌发率为71.67%，明显高于光照条件下的35.46%和光暗交替条件下的53.07%，可见黑暗条件促进孢子萌发。

2.2.4分生孢子致死温度测定病菌的分生孢子经≥58 ℃的几个温度处理后，均不萌发，表明该菌分生孢子的致死温度为58 ℃。

3讨论

Saccardo于1884年首次对榛子叶斑病进行记载，确定其病原为榛叶点霉[4]。于莉等于1994年首次在吉林地区发现榛叶点霉生于榛叶片上[7]。笔者于2013年在辽宁地区首次发现该病，并以报道[5]。此外，未见相关榛子叶斑病的报道。叶点霉能寄生于多种草本和木本植物的叶片上，在条件适宜的情况下，可对植株进行侵染并引起叶斑类病害，如小叶黄杨叶斑病（P. spinarum）[8]，龙眼白星病（P. dimocarpi）[9]，八仙花叶斑病（P. hydrangeae）[10]等。

本试验在鉴定确准为榛叶点霉基础上，首次对该病原菌的生物学特性进行系统研究。研究结果表明，榛叶点霉的适宜生长范围为20～25 ℃，最适温度25 ℃，与此病在辽宁省5月下旬至6月上旬开始发病，6—7月高温多雨季节有利于病害迅速传播蔓延的发病规律相吻合。有关病菌的生物学特性研究，未见相关报道。在PDA培养基中，该菌的pH值适应范围较宽，在pH值3～11下均可生长，在pH值7～9即偏碱性的条件下菌丝生长较快，而适合孢子萌发的pH值相对较窄为pH值4～8，在pH值5～7即酸性条件下孢子萌发率最高。该病原菌生长对营养要求并不严格，多数供试碳源均能满足生长的需要，最适碳源为麦芽糖；最佳供试氮源为甘氨酸。病原菌分生孢子致死温度经5次累积25次重复验证确定为 58 ℃，表明其抗逆性较强，所以病菌在高温季节可能具有较强的存活能力和侵染能力而导致病害扩大蔓延的趋势不容忽视。

作为榛子生产上的新病害，笔者对其病原菌生物学特性进行测定研究，这对开展预测预报、适时综合防治、有效控制榛子叶斑病的扩大蔓延具有一定理论指导意义。同时，对于病原菌致病机理等已开展深入研究，以期为经济林作物的科学防治提供理论依据。

参考文献：

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[2]姜殿勤，王素玲，张俭卫. 野生平榛综合开发利用初探[J]. 特种经济动植物，2005，8（10）：19-20.

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[4]Saccardo P A. Sylloge fungorum omnium hucusque cognitorum[M]. Patavii：Typis Seminarii，1884.

[5]Sun J，Wang D M，Huang X Y，et al. First report of a leaf spot on hazel leaves caused by Phyllosticta coryli in Liaoning Province of China[J]. Plant Disease，2013，97（9）：1254.

[6]方中達. 植病研究方法[M]. 北京：中国农业出版社，1979：140-155.

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[8]邵阳，刘秋，胡英畅，等. 小叶黄杨叶斑病菌YC06生物学特性与杀菌剂筛选[J]. 东北林业大学学报，2011，39（7）：138-140.

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