孙帅玲，马晓北

(中国中医科学院中医基础理论研究所,北京 100700)

高脂血症是由体内胆固醇及甘油三酯升高引起的全身性慢性代谢性疾病。流行病学调查显示我国高脂血症的发病率逐年上升，且呈年轻化趋势，近年来随着生活节奏加快，暴饮暴食、嗜酒、运动减少、社会压力大、精神高度紧张等危险因素导致高脂血症发病率居高不下[1]。血脂升高可引起血液黏稠度增加，损伤血管内皮，产生炎症因子,刺激机体产生C-反应蛋白，最终导致动脉粥样硬化。研究发现高脂血症是动脉粥样硬化、心脑血管疾病、肥胖、脂肪肝等疾病的重要危险因素之一[2]。临床上西医治疗常选用他汀类药物、贝特类药物等降脂药物，但服药周期长，且不良反应较多[3-5]。茵陈蒿汤由茵陈蒿、大黄、栀子三味中药组成，临床中常用于治疗肝胆疾病、高血脂症、Ⅱ型糖尿病、急性胰腺炎、癌症等。本研究基于网络药理学方法，构建茵陈蒿汤治疗高脂血症的分子作用网络，通过分析分子间相互作用，系统阐释茵陈蒿汤治疗高脂血症的作用机制，为高血脂症临床用药提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究资料 本研究所采用的平台及数据库主要有中药系统药理学技术平台(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP)、Genecards数据库、TTD数据库、OMIM数据库、Uniprot数据库、String数据库以及Metascape平台和Cytoscape 3.7.1软件。

1.2 研究方法

1.2.1 茵陈蒿汤活性成分及蛋白质靶点筛选：通过TCMSP数据库检索茵陈、大黄、栀子的活性成分，以口服生物利用度(OB)≥30%以及药物相似性(DL)≥ 0.18为条件筛选其作用的蛋白质靶点，使用Uniprot蛋白质数据库规范靶点名称。

1.2.2 高脂血症相关靶点筛选：以“hypercholesterolemia”“hyperlipidemia”“hypertriglyceridemia”为关键词检索TTD数据库、Genecards数据库、OMIM数据库中与高脂血症相关的潜在靶点。将在Genecards数据库中筛选的靶点条件设定Score大于中位数的目标靶点作为高脂血症的潜在靶点，将3个疾病数据库中所筛选到的靶点进行合并，删除重复值，获得高脂血症相关靶点。

1.2.3 构建共同靶点PPI网络：将茵陈蒿汤活性成分靶点与高脂血症靶点进行映射取交集，得到韦恩图。String数据库的作用在于预测及分析蛋白质与蛋白质之间相互作用[6]。将映射后所得共同靶点导入String 11.0数据库构建蛋白互作网络模型，生物种类限定为人，将得到的结果输入Cytoscape 3.7.2内置工具分析靶点的网络拓扑参数，计算其度值(Degree)，筛选核心靶基因。

1.2.4 共同靶点富集分析和通路分析：基因本体论 (Gene ontology，GO)及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析旨在探究相关基因主要涉及的分子功能和生物过程[7]。Metascape平台旨在提供全面的基因列表注释和分析资源[8]。通过Metascape平台对茵陈蒿汤-高脂血症共同靶点进行GO分析以及KEGG分析，根据结果绘制柱状图。

1.2.5 “茵陈蒿汤成分-靶点-通路”网络图的构建：Cytoscape作为一种可视化软件，能够直观分析药物治疗疾病的作用机制[9]。本研究在获得茵陈蒿汤有效活性成分、共同靶点、通路的基础上，利用Cytoscape 3.7.1软件构建“成分-靶点-通路”互作网络，并进行可视化分析。

2 结 果

2.1 茵陈蒿汤活性成分及靶点信息 通过TCMSP数据库获取茵陈化学成分53种、大黄化学成分92种、栀子化学成分98种，以OB≥30%、DL≥ 0.18为筛选条件，并去除没有对应靶点的成分后，共得到活性成分17种，其中茵陈活性成分3种、大黄1种、栀子12种，见表1。

表1 茵陈蒿汤主要活性成分基本信息表

2.2 高脂血症相关靶点信息 以“hypercholesterolemia”“hyperlipidemia”“hypertriglyceridemia”为关键词检索Genecards数据库，获得高脂血症靶点分别是1373个、1566个、1612个。根据经验，Score大于中位数的目标靶点为高脂血症的潜在靶点，将上述靶点与在OMIM数据库、TTD数据库、DRUGBANK数据库获得靶点合并，删除重复部分，获得高脂血症相关靶点1469个。

2.3 茵陈蒿汤治疗高脂血症PPI网络分析 将获取的茵陈蒿汤主要活性成分对应的170个作用靶点和1469个高脂血症靶点进行交集分析，得到交集靶点57个。将其录入String数据库中，删除游离蛋白ADH1C，得到蛋白互作网络。将结果tsv文件导入Cytoscape 3.7.1软件中进行拓扑参数分析，得到茵陈蒿汤治疗高脂血症的关键核心靶点，然后根据节点度值大小进行排列。由Network analyzer工具筛选出该网络中Degree值排名前10的靶蛋白，分别是细胞IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、TP53、EGF、NOS3、MAPK1、PTGS2、MMP9，图中颜色越深，圆圈越大，度值越大，节点越重要(图1)。

图1 茵陈蒿汤治疗高脂血症PPI 网络图

2.4 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析 对茵陈蒿汤药物与高脂血症的核心靶点进行GO功能分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要涉及细胞对活性氧代谢过程、脂质的反应、对脂多糖的反应、对营养水平的反应等生物学过程(图2A)；调节血脂的功能主要富集在核受体活性、类固醇激素受体、磷酸酶结合、脂质结合、类固醇结合、一氧化氮合酶调节活性等过程(图2B)；主要参与膜筏、膜微区、膜区、质膜筏等细胞组分的组成(图2C)。KEGG通路富集分析主要涉及AGER-AGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、HIF-1信号通路等(图2D)。

图2 茵陈蒿汤治疗高脂血症核心靶点GO富集柱状图和KEGG通路气泡图

2.5 “成分-靶点-通路”网络图的构建 选取排名前20的KEGG代谢通路，将文件导入Cytoscape中，通过CytoScape 3.7.1内置的Network Analyzer 绘制茵陈蒿汤成分-靶点-通路网络(图3)。黄色圆形节点为不同药物的活性成分，菱形为靶点，倒三角为通路，由图观察可知，槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)等活性成分所对应的靶点个数较多，在通路方面，AGER-AGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、HIF-1信号通路对应得靶点较多，这意味着个数越多，在调制高脂血症方面发挥的作用越大。

图3 茵陈蒿汤治疗高脂血症“成分-靶点-通路”网络图

3 讨 论

中医学虽无高脂血症病名，但早在《黄帝内经》中已有“脂者”“油脂”“脂膜”等记载，《灵枢·卫气失常》：“脂者，其血清，气滑少”这是最早论及脂者的记载。根据症状其病机可归属“瘀血”“痰浊”的范畴[10]。瘀血、痰浊是人体津、血代谢失常形成的病理产物，属于继发性因素，影响津液、膏脂的运化与输布，诸多研究亦证实高脂血症的病机与瘀血、痰浊相关[10-11]。津液停聚，痰湿内生，脉道闭阻，气机郁滞，血行不畅而致瘀；血瘀又致液聚痰停，痰浊留脉，脉络不畅，痰瘀互结，引发高脂血症，进一步发展，致脉痹、中风等。高脂血症由于无明显临床症状、进展缓慢，早期易被忽视[12]。多项研究结果表明高脂血症与颈动脉硬化、心血管疾病的发生密切相关[13-14]。中医认为其病因可分为以下几点：一是饮食失节，嗜食肥甘厚味，滋生湿热；二是好逸恶劳，气机不畅，气血壅滞；三是情志不舒，气郁不舒；四是先天禀赋不足，或年老肾精亏虚，导致脏腑功能失调，气血津液运行失畅，生脂聚痰，瘀阻脉络，发为本病。该病与肝、脾、肾三脏关系密切，故治疗上应调理肝、脾、肾三脏，同时注重化痰祛瘀。近年来，中药治疗高脂血症的临床研究不断深入，药理研究结果显示其主要通过以下四点发挥作用：一是抑制外源性脂类和胆酸的吸收；二是抑制脂类物质的合成；三是降低血黏度、激活纤溶、抑制凝血减少脂类物质在血管内皮的沉积；四是通过抗氧化等发挥降脂作用[15-19]。

茵陈蒿汤方中君以茵陈苦泄下降，清热利湿；臣以栀子清热降火，通利三焦，助茵陈引湿热从小便而去；佐以大黄泻热逐瘀，通利大便，导瘀热从大便而下。Shindoh等[20]研究发现茵陈中含有的槲皮素、β-谷甾醇、异鼠李素等有效成分具有抗肿瘤、抗炎、调节免疫、保肝利胆、调节心血管系统等作用；大黄中蒽醌类成分含有的大黄酸和大黄素在抗病毒、保肝护肾、保护胰腺、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、减轻脑缺血损伤、保护心血管系统均具有一定的功效[21-22]。栀子主要药理成分包括黄酮类化合物、萜类化合物、有机酸酯类、挥发油、多糖以及各种微量元素等[23]，现代药理研究显示栀子在调脂[24]、抗炎[25]、抗氧化[26]等方面具有一定的功效。本研究通过网络药理学研究发现茵陈蒿汤治疗高脂血症的活性成分主要包括槲皮素、β谷甾醇、山奈酚、异鼠李素等。研究发现槲皮素的代谢产物通过抑制成熟脂肪细胞中葡萄糖摄取和甘油三酯形成达到降脂效果；槲皮素及其苷类化合物通过调节脂质分解、合成、代谢对高脂血症、肥胖症等非传染性慢性病起到防治作用。β-谷甾醇因与胆固醇的结构相似，通过竞争抑制肠道对胆固醇的吸收，抑制酯化酶，促进胆固醇排泄。山奈酚通过下调SREBPs增加脂质代谢，促进ACO和CYP4A1的表达，进而直接上调肝脏PPAR-α的表达，减少内脏脂肪堆积，改善高脂血症。研究显示异鼠李素具有保护血管内皮细胞、抑制脂肪分化、抑制血管内皮细胞增殖、调节免疫功能、耐缺氧、抗炎等作用，可以通过下调3T3-L1脂肪细胞中的PPAR-γ和CEBP-α抑制脂肪生成[27]。

通过蛋白互作分析发现IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、TP53、EGF、NOS3、MAPK1、PTGS2、MMP9等是茵陈蒿汤治疗高脂血症的潜在靶点。其中，IL-6、TNF、VEGFA、PTGS2、MMP9是重要的炎症因子[27]，同时IL-6、TNF等是促进动脉粥样硬化发生、发展的重要因素。Cavieres等[28]在实验中发现IL-6通过反式激活因子-3抑制内皮细胞NO和eNOS的水平，损伤内皮细胞功能；AKT1参与代谢、胰岛素信号传导、血管生成等多种生物学过程；VEGFA是调节脂肪组织中血管生成的重要因子，TP53通过调节基因的表达诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老等过程。由上可知，茵陈蒿汤主要通过参与炎症因子、脂肪组织的形成与维持、脂肪组织中血管生成等生理过程发挥其调治高脂血症的目的。KEGG通路富集分析发现茵陈蒿汤治疗高脂血症的主要通路包括AGER-AGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、HIF-1信号通路等。AGE-RAGE信号通路能够介导动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等多种慢性病变，高水平AGE能激活并参与脂肪储存、炎症、氧化应激和细胞因子合成等；研究显示高脂、高糖饮食等不良生活方式可增加、积累AGEs[29]，AGEs与其细胞受体RAGE结合激活核因子kappa-B，增加炎症细胞因子的表达和释放以及产生氧自由基，进而导致细胞功能障碍；HIF-1信号通路通过控制长链酰基辅酶A脱氢酶(包括MCAD、LCAD)，降低活性氧水平及增加脂肪[30]。在高脂血症向动脉粥样硬化发展过程中，流体剪切应力与动脉粥样硬化通路也发挥重要的预防或抑制作用。血流紊乱产生的低切应力和振荡剪应力则可引起动脉粥样硬化，层流血流产生的流体剪应力可以保护血管免受动脉粥样硬化的损害，RAGE的受体sRAGE通过阻断血流紊乱引起的RAGE信号通路发挥抗动脉粥样硬化作用[31]。茵陈蒿汤可能通过抑制脂肪生成、代谢，促进胆固醇排泄，调节炎症反应、血管重塑等发挥调节血脂作用，预防动脉粥样硬化发生。

综上所述，中药通过多组分、多靶点、多途径发挥治疗疾病的作用。本研究运用网络药理学方法分析茵陈蒿汤治疗高脂血症的作用机制，发现茵陈蒿汤调节高脂血症的作用机制具有多成分-多靶点-多通路的特性。本研究为茵陈蒿汤治疗高脂血症的基础研究和临床应用提供参考，但由于网络药理学的局限性，后期将在此基础进一步筛选予动物或细胞实验加以验证，进一步明确茵陈蒿汤治疗高脂血症的主要作用机制。