方锦颖,王一冲,神原优滋(日本)，李文歌，3

(1.北京中医药大学，北京100029；2.北京大学医学部，北京100191；3.中日友好医院肾病科，北京100029)

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见微血管并发症，以高血压、蛋白尿、肾功能下降，最终导致肾衰竭为主要表现。目前DN是导致终末肾脏病(End-stage renal disease，ESRD)的首要原因[1-2]。中医药在DN治疗中起着重要作用[3]。中医理论中，DN病机以气阴两虚为本，“瘀”是其重要致病因素，益气养阴、活血化瘀已成为治疗DN的重要原则[4]。肾康注射液由黄芪、丹参、大黄、红花的提取物组成，具有通腑泄浊、活血化瘀、补气利湿等功效[5]。近年来，临床常应用肾康注射液延缓DN进展，疗效较好。现代药理学发现肾康注射液具有改善脂代谢，纠正淋巴细胞紊乱，抑制免疫炎症反应，抑制肾小球系膜细胞增生，减缓肾脏纤维化，延缓肾小球硬化等作用[6-8]。中药制剂成分复杂，作用机制多样，对于肾康注射液治疗DN的通路缺乏系统性认识。网络药理学基于系统生物学相关理论，联合数据库，通过“药物-有效成分-靶点-疾病”的方式，研究药物治疗疾病作用机制[9-10]。本文运用网络药理学方法，结合文献研究、数据发掘、统计分析等手段，收集肾康注射液有效成分、作用靶点及DN靶点等，构建肾康注射液与DN相互作用网络，探究肾康注射液治疗DN作用机制。

1 资料与方法

1.1 文献来源与分析平台 TCMSP数据库、Uniprot数据库、Genecards数据库、Active Perl软件、String数据库、PDB数据库、Cytoscape 3.6.1软件、R3.6.2软件、Discovery studio软件、Pymol软件、Autodock软件。

1.2 研究方法

1.2.1 肾康注射液有效成分的收集及筛选：通过TCMSP数据库，收集丹参、红花、大黄及黄芪的主要活性成分。根据Lipinski五规则及相关文献[11]对成分毒药物动力学参数进行设置，筛选出在人体内生物活性较高的成分，筛选条件为药物相似性(DL)≥0.18、分配系数≤5、氢键给体≤5、氢键受体≤10。

1.2.2 收集肾康注射液相关靶点：通过TCMSP数据库筛选出肾康注射液的所有作用靶点，通过Active Perl软件筛选后，得到药物活性成分的对应靶点。进一步使用Uniprot数据库对药物靶点信息进行规范化处理，查找蛋白质名称，限定物种为人，获取唯一的Uniprot ID，得到药物靶点ID。

1.2.3 收集DN相关靶点：从Genecards数据库获取与DN相关的靶点，并导入Uniprot数据库的相应Uniprot ID，得到疾病靶点ID。

1.2.4 收集肾康注射液与DN共同靶点：通过R3.6.2软件，将前期获得的肾康注射液靶点及DN相关的靶点取交集，得到肾康注射液与DN共同靶点。

1.2.5 “药物-有效成分-靶点-疾病”网络构建：将药物-疾病共同靶点及药物靶点基因ID通过Active Perl软件，获得network文件，type文件，药物有效成分3个文件。3个文件通过Cytoscape 3.6.1软件获得药物-有效成分-靶点-疾病网络，并对其进行注释及美化。

1.2.6 蛋白质互作(Protein-protein interaction，PPI)网络构建：PPI网络是由蛋白通过彼此之间的相互作用，来参与调节基因表达、传递生物信号、物质及能量代谢、调控细胞周期等生命过程的各个环节[12]。通过String数据库，输入前期获得的共同靶点信息，物种选择Homo sapiens(智人)，选择置信度得分>0.90以确保结果的准确性，去除独立的基因，构建PPI网络。通过R3.6.2软件得到PPI网络核心基因。

1.2.7 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析：功能富集分析是将基因或者蛋白列表分成多个部分，即将获得的基因根据功能或其他标准进行分类，将具有相似功能的基因放到一起，并将其与生物学表型关联起来[12]。使用前期获得的共同靶点，通过R3.6.2软件、Active Perl软件对靶点基因进行富集分析，包括GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，设定P<0.05并使用Bonferroni检验法进行校正，并筛选出具有统计学意义的生物学过程和信号通路。

1.2.8 分子对接：选择PPI网络中Degree值最大的10个靶点作为受体，与纳入研究的肾康注射液活性成分进行分子对接。在PDB数据库下载受体的人源性蛋白结构，逐一导入Discovery studio软件进行分子结构常规预处理。TCMSP数据库下载肾康注射液主要各活性成分的SDF三维结构作为配体，导入Pymol软件、Autodock软件进行常规预处理，并逐一对主要药物活性成分和配体进行对接，制作热力图。

2 结 果

2.1 肾康注射液有效成分及靶点的收集及筛选 通过TCMSP数据库检索并通过设置ADME参数筛选后得到大黄有效成分16个、丹参有效成分65个、红花有效成分22个、黄芪有效成分20个，筛选重复后得到有效成分共120个。通过TCMSP数据库、Active Perl软件获得上述有效成分的作用靶点，除去重复靶点后，共得到有效成分对应靶点2219个，同时在Uniprot数据库中查找主要活性成分作用靶点的相应Uniprot ID，去除重复和非人源靶点，得到1948个靶点，即药物靶点ID。

2.2 DN靶点筛选 从Genecards数据库共收集到与DN相关的靶点4444个，将靶点名导入Uniprot数据库，获得4444个Uniprot ID 。

2.3 肾康注射液与DN共同靶点 通过R3.6.2软件，将前期获得的肾康注射液靶点及DN相关的靶点取交集，得到183个肾康注射液与DN共同靶点。

2.4 “药物-有效成分-靶点-疾病”网络图构建 将肾康注射液与DN共同靶点及药物靶点基因ID通过Active Perl软件、Cytoscape 3.6.1软件获得药物-有效成分-靶点-疾病网络。其中橘色节点表示肾康注射液有效成分有37种；绿色节点表示DN和肾康注射液交集靶点184个；红色节点代表DN；黄色节点代表肾康注射液(图1)。

图1 “药物-有效成分-靶点-疾病”网络图

2.5 PPI网络构建 通过String数据库，输入前期获得的疾病-药物交集靶点，物种选择智人(Homo sapiens)，设置置信系数>0.9，去除独立的基因，构建PPI网络，共有基因167个，连线718条(图2)。

图2 肾康注射液有效成分与DN共同靶点PPI网络图

2.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 将肾康注射液与DN的183个共同靶点通过R3.6.2软件进行GO功能富集分析，共得到169条生物过程，主要涉及免疫炎症反应、代谢通路等生物学过程(图3)。KEGG信号通路富集分析结果，共得到174条信号通路，通过KEGG数据库进一步查找信号通路相关信息及通路图，其中与DN相关的通路59条，主要涉及免疫炎症反应、能量代谢调节、自噬等(图4)。

图3 肾康注射液与DN共同靶点GO功能富集分析气泡图

2.7 分子对接 选取PPI网络中“Degree”值最大10个靶点，与肾康注射液的6个主要活性成分进行分子对接，对接得分经过热力图分析得出结果。其中，对接得分≤-9.0 kcal/mol的成分有3个，占5.0%，其余对接得分均在-9.0～-5.0 kcal/mol之间(图5)。一般认为对接得分≤-5.0 kcal/mol时，药物活性成分与靶点具有较好的结合活性，因此肾康注射液的主要活性成分与重点靶点之间具有较好的结合能力。同时，发现甲基黄连碱(Worenine)与目标靶点对接得分均≤-7.0 kcal/mol，其中30 %对接得分≤-9.0 kcal/mol。JUN、丝裂原激活蛋白激酶8(Mitogenactivated protein kinases 8，MAPK8)、APP与所有主要药物活性成分结合分数均≤-7.0 kcal/mol。由此推测甲基黄连碱等成分可能是肾康注射液治疗DN的有效成分，MAPK8、APP可能是其主要作用靶点。

3 讨 论

DN发病机制与免疫炎症、血流动力学改变、氧化应激、代谢紊乱、遗传等因素有关[13-14]。中医认为DN病机以脏腑内虚为本，瘀血痰浊为标，治疗上根据辨证，采用补虚活血泻浊、益气活血、补肾化瘀、化瘀散结等方法[15]。肾康注射液能够兼顾DN患者本虚标实的特点，一定程度上减少DN患者的尿蛋白，改善肾功能，延缓疾病进一步发展。肾康注射液中黄芪益气袪湿，丹参、红花的提取物具有活血化瘀的功效，大黄通腑泄浊，对于DN气血运行不畅形成浊邪具有良好的治疗效果。本文通过网络药理学的方法构建肾康注射液治疗DN的“药物-有效成分-靶点-疾病”网络，对其涉及的信号通路及生物学过程进行分析，发现肾康注射液治疗DN是通过多途径发挥作用。涉及的主要生物学过程有免疫炎症反应、能量代谢、水盐代谢调节、改善局部微循环、调控细胞周期等。通过分子对接发现，肾康注射液6个主要活性成分均能与DN的10个主要靶点结合，肾康注射液可能通过JUN、MAPK8、APP等靶点，调节免疫炎症反应、凋亡等通路，延缓DN进展。

DN患者常合并代谢综合征，高血糖、高脂血症、高尿酸血症等代谢疾病又进一步加重肾脏损伤。在高血糖状态下，人体产生不可逆糖化蛋白质即晚期糖基化终产物(AGEs)。当AGEs不能完全被肾脏近端小管内吞、溶酶体降解时，AGEs大量积累，促进炎症因子释放，激活炎症反应，促使糖尿病肾病发生发展[14]。血管内皮生长因子B(VEGF-B)在DN患者体内高水平表达，肾脏脂肪变性，抑制VEGF-B信号传导可降低肾脏的脂毒性，提高足细胞对胰岛素信号敏感性，延缓DN进展[14，16]。肾康注射液可通过调节VEGF-B等信号传导，降低肾脏的脂毒性。血压控制不佳是导致DN进展的重要因素，肾康注射液通过作用于RAAS系统起到一定的调节血压作用[16]。网络药理学研究表明，肾康注射液中鼠李柠檬素、野黄芩素等有效成分可以作用于表皮生长因子受体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1、血管内皮生长因子A等靶点基因，通过血管内皮生长因子信号通路、脂肪细胞素信号通路、胰岛素信号通路等16条信号通路，从改善胰岛功能、提高机体对胰岛素敏感性、调节肾脏局部血压等多方面改善DN患者代谢紊乱，减少尿蛋白，延缓肾脏衰竭。

炎症反应在DN发病过程中处于重要地位。白介素-18、白介素-1β、Toll样受体-2等炎症因子造成全身和局部低度炎症与DN的发生发展密切相关，且在调节免疫紊乱中发挥重要作用。血管内皮蛋白酪氨酸磷酸酶与糖尿病并发症的发展有关，抑制血管内皮蛋白酪氨酸磷酸酶表达，减少促炎和纤维化基因靶点表达，延缓DN进展[17-18]。肾康注射液中决明内酯、6-羟基山柰酚、泽兰黄醇、熊竹素等作用于一氧化氮合酶-3、白介素-6、核受体共激活剂-2、MAPK-8等靶基因，通过T淋巴细胞、肿瘤坏死因子、Toll样受体信号通路等，调节人体免疫反应，减少炎症因子产生。

自噬在多种急慢性肾脏疾病中起着重要作用，可与细胞凋亡、能量代谢、免疫炎症反应等过程相互影响。有研究表明，在DN模型小鼠出现内皮细胞特异性自噬缺陷后可加重蛋白尿，导致疾病恶化[19]。同时内皮细胞特异性自噬缺陷的小鼠对高糖高脂饮食耐受性下降，易出现肾功能受损。自噬通过降解AGEs，提高溶酶体活性，减轻炎症反应，保护足细胞。肾康注射液通过酪氨酸激酶抑制剂抵抗相关信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶信号通路等减轻肾脏损伤。