王炎炎，翟凤霞

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450462；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510504)

新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19)传染性强，传播途径广泛，人群普遍易感，感染者易出现急性肺损伤，且出现多系统并发症[1-3]。新型冠状病毒肺炎属于中医“瘟疫”“疫病”范畴，病机为邪气内侵、正气不足，病位在肺，基本病机特点为“湿、热、毒、瘀”。我国预防COVID-19以中医药为主，实践证明中医药对其有较好的防治作用[4-7]。经河南省疾控中心实验室病毒测序，河南省本轮疫情主要为德尔塔毒株引起，其传播能力在现有毒株中最强，能更好的逃避宿主免疫系统，有传播速度快、病毒载量高、发病时间短、治疗时间长、隐匿性强等特点[8]。

中医“治未病”思想贯穿COVID-19预防、治疗和康复的全过程，通过调理体质、扶正祛邪等，未病先防，既病防变，是防疫的重要屏障之一，且能缓解患者症状，减少轻症向重症发展，提高治愈率，降低病死率，促进恢复期患者康复[9-10]。从“三因制宜”学说来看，河南省本次新冠肺炎发病在夏季和洪涝之后，“湿毒夹暑”的特征较为明显。2021年8月，郑州市新冠肺炎疫情防控领导小组办公室发布新冠肺炎预防处方(成人方)，以期降低传染风险，处方以健脾利湿、清热解暑为治则，具体方药：黄芪、白术、防风、茯苓、陈皮、苍术、藿香、薏苡仁、金银花、连翘、贯众。本文基于网络药理学初步探讨河南省新冠肺炎预防方(成人方)预防COVID-19的作用机制，并运用分子对接技术寻找配体与受体活性位点的低能结合模式[11-14]，为临床及基础科学研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究资料 本研究数据来源及运算平台包括中药系统药理学数据库及分析平台(Traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)、人类基因数据库Gene Cards、人类在线孟德尔遗传学数据库(Online mendelian inheritance in man，OMIM)、String数据库、Pub Chem数据库、蛋白质结构数据库(Protein data bank，PDB)、Uni Prot数据库、Strawberry-Perl 5.30.2.1软件、Cytoscape 3.8.2软件、R 4.1.0软件、ChemBio3D Ultra 14.0软件、PyMOL软件、Auto Dock 软件、Vina软件。

1.2 研究方法

1.2.1 河南省新冠肺炎预防方(成人方)有效成分及靶点收集：在TCMSP数据库内以“黄芪、苍术、白术、防风、藿香、薏苡仁、茯苓、金银花、连翘、陈皮、贯众”11味药物为检索词，并以口服生物利用度(OB)≥30%、药物相似性(DL)≥0.18作为筛选条件[15-16]。在TCMSP靶点模块查询单味中药活性成分靶点，通过Strawberry-Perl 5.30.2.1软件和Uni Prot数据库将靶点蛋白名称转换为靶点的标准基因名称。使用Cytoscape 3.8.2软件进行可视化处理，构建“活性成分-疾病-靶点”网络图。

1.2.2 COVID-19相关靶点收集：通过Gene Cards、OMMI数据库，分别使用“Novel coronavirus pneumonia”“New coronavirus”为关键词进行检索，以Execl文件导出，汇总整理COVID-19相关靶点，得到疾病相关靶点。

1.2.3 蛋白相互作用网络构建及拓扑分析：通过R 4.1.0软件和Venn Diagram工具包，将疾病靶点和药物活性成分对应的靶蛋白取交集，生成韦恩图及活性成分与疾病靶点的交集文件。利用String数据库，将所得交集文件导入，设置检索物种为“Homo sapiens”，Score值≥0.9进行筛选。将筛选结果导入Cytoscape 3.8.2软件，通过Cytoscape的CytoNCA插件筛选网络中的重要节点。

1.2.4 GO功能富集和KEGG通路分析：将有效活性成分与疾病靶点的交集基因通过R 4.1.0软件进行GO功能富集和KEGG通路分析，结果导出后，以P≤0.01为条件筛选通路，使用R语言对结果进行可视化处理。

1.2.5 分子对接：依据度值，选取排名前5位的多味中药共有活性成分，与3C样蛋白酶(3-chymotrypsin-like protease,3CLpro)和血管紧张素转换酶Ⅱ(Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)进行分子对接，从Pub Chem 数据库下载关键化合物2D结构，通过ChemBio3D Ultra 14.0构建3D结构，完成小分子配体文件准备；从PDB数据库下载获取3CLpro(PDB ID∶6LU7)及ACE2(PDB ID∶1R42)的3D结构，使用PyMOL软件对 6LU7、1R42去水、删除小分子配体等，完成蛋白受体准备。利用Auto Dock软件将化合物及靶蛋白格式转换为PDPQT格式，寻找活性口袋，最后运行Vina将河南省新冠肺炎预防方(成人方)中核心活性成分与6LU7、1R42分别进行分子对接。

2 结 果

2.1 河南省新冠肺炎预防方(成人方)活性成分-靶点-疾病网络图 在TCMSP中以 OB≥30%且 DL≥0.18为筛选条件，共得到活性化合物147个。从OMOM、Gene Cards中分别获取到14、2559个COVID-19相关靶点，在Gene Cards中设定Relevancescore≥1.0基因共得到2431个相关靶点，去重后共获得2428个COVID-19相关靶点，将河南省新冠肺炎预防方(成人方)有效成分预测靶点与COVID-19的靶点通过R软件“Venn Diagram”取交集，最终得到165个河南省新冠肺炎预防方(成人方)预防COVID-19的预测靶点。将有效成分、靶点进行整理，构建河南省新冠肺炎预防方(成人方)预防COVID-19成分-靶点网络图(图1)，共得到249个节点，775条边。

图1 成分-靶点网络图

2.2 PPI网络构建 药物活性成分与疾病共有165个共同靶点，通过String软件对潜在靶点进行蛋白互作分析，将结果导入Cytoscape，借助CytoNCA插件进行拓扑结构分析，通过Degree、Closeness Centrality、Betweenness Centrality等节点参数进行核心节点筛选，获得河南省新冠肺炎预防方(成人方)预防COVID-19的16个核心靶点(图2)。

图2 核心靶点图

2.3 GO功能富集和KEGG通路分析 通过R软件进行GO功能富集分析，得到GO条目2746个，其中生物过程(BP)条目2443个，细胞组成(CC)条目98个，分子功能(MF)条目205个，分别占88.9%、3.5%、7.4%，取排名前20位的条目(图3)。KEGG通路筛选得到179条信号通路，涉及新型冠状病毒肺炎、甲型流感、军团菌病、PI3K-Akt、MAPK、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、T细胞受体等信号通路，其中新型冠状病毒肺炎涉及MAPK14、RELA、JUN、IL6ST、MMP1、CCL2、CXCL8、MAPK3、MAPK1、MAPK8、PRKCA、IKBKB、STAT1、MMP3、EGFR、FOS、NFKBIA、IL1B、IL2、CXCL10、CHUK，取排名前20位的条目(图4)。

图3 作用靶点GO功能分析图

图4 作用靶点KEGG富集分析图

2.4 SARS-CoV-2 3CLpro及ACE2受体与活性化合物分子对接验证 河南省新冠肺炎预防方(成人方)11种中药中度值位于前5名的活性成分为槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、木犀草素，分别与3Clpro、ACE2进行对接。分子对接结果显示核心活性化合物与3CLpro及ACE2 受体的分子对接亲和力均<5.0 kJ/mol，提示核心活性化合物与3CLpro及ACE2 受体有较好的结合活性，见表1(图5)。

表1 河南省新冠肺炎预防方(成人方)核心活性成分与3CLpro和ACE2的结合能

图5 核心活性成分与3CLpro和ACE2分子对接图

3 讨 论

本研究共得到河南省新冠肺炎预防方(成人方)147个有效活性成分。通过“药物-活性成分-靶点”网络分析中发现槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、木犀草素等11个化合物的度值远高于平均度值，提示其为该方的关键活性成分。其中槲皮素是度值最高的有效成分，药理研究显示，槲皮素通过阻断 MAPK信号通路活化，抑制炎症细胞因子释放，降低组织和机体的炎症反应，具有抗癌、抗氧化及清除自由基、抗炎、抗血栓、抗病毒、改善肺纤维化、心血管保护及免疫调节等重要的药理学作用。木犀草素有抗炎、抗过敏、降尿酸、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等药理活性，在体外具有抗甲型流感病毒活性[17-18]。何黎黎等[19]发现，汉黄芩素通过抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的表达，减少肺组织炎性病理损伤和炎症。山奈酚有抗氧化、抗炎、抗癌、保护损伤细胞多种功能，体外研究已证明山奈酚具有体外抗氧化能力，其可通过抑制p38MAPK信号通路发挥抗炎和神经保护作用，且对急性肺损伤有一定的保护效应，可显著抑制急性肺损伤引起的氧化-抗氧化平衡失调[20-22]。β-谷甾醇在体外试验能有效降低炎性细胞因子的过表达，保护脂多糖所致的小鼠急性肺损伤，表现出良好的免疫调节和抗炎活性[23-24]。

在Cytoscape软件CytoNCA插件进行拓扑结构分析，获得河南省新冠肺炎预防方(成人方)预防COVID-19的关键靶点共16个，这些可能是该方的潜在靶点。SARS-CoV-2通过其表达的刺突蛋白结合ACE2进入细胞，病毒侵入机体而致病[25]。有研究在感染SARS-CoV-2的细胞中分离出ACE2，证实细胞中ACE2的表达量与刺突蛋白的易感性呈正相关，当宿主细胞转染ACE2后，病毒的复制能力增强[26]。3CLpro是病毒复制过程至关重要的蛋白酶，它能将两个病毒翻译过程中的多聚蛋白PPIA和PP1AB水解成单独的功能成分，且3CLpro序列高度保守，目前在人体尚未发现其他相似的水解酶[27-29]。故将3CLpro、ACE2作为靶标筛选蛋白受体。分子对接结果显示，该方主要化学成分与3CLpro、ACE2结合能均远小于-5.0 kJ/mol，提示筛选所得化学成分均能和受体蛋白结合性好、亲和力高，构象稳定。

GO功能富集分析结果显示，其主要涉及活性氧生物合成过程，凋亡信号通路，细胞对外界刺激、化学应激及药物的反应，炎症反应的调节、受体配体活性、趋化因子等生物过程，通过调控炎症、细胞增殖、免疫、抑制氧化应激状态等预防COVID-19。KEGG通路分析结果显示，该方在防治疾病中可能涉及COVID-19、甲型流感、军团菌病、PI3K-Akt、MAPK、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、T细胞受体等信号通路，证明其活性成分通过多途径调节免疫及炎症反应，减少机体损伤，发挥治疗作用。

本研究表明河南省新冠肺炎预防方(成人方)通过多成分、多靶点、多通路对COVID-19的预防发挥作用，为临床应用及进一步研究提供一定的理论依据和参考。但尚未对本研究预测的通路进行验证，且河南省新冠肺炎预防方(成人方)的活性成分在体内生物效应复杂，需进一步验证各成分间是否具有协同或拮抗作用。