肖 洋，柯 婷，李 婷，王高雷，杭 程，王露露，师韩菲，董丹丹，祁海燕

(陕西省中医医院，陕西 西安 710003)

随着现代社会生活水平不断提高，糖尿病合并脂肪肝人群与日俱增。据流行病学调查研究显示，健康人群脂肪肝发病率约为20%～30%[1]，而在糖尿病患者人群中约76%患者合并脂肪肝，脂肪肝患者血糖损害或糖尿病发病率约18%～33%[2-3]。长期糖脂代谢紊乱可导致血管、神经、心脏等组织器官功能缺陷和衰竭，加重肝脏脂肪样变，可进一步产生或加重肝脏细胞癌变及心血管事件风险，严重危害人类健康[4-6]。目前公认的胰岛素抵抗是两者共同发病机制，胰岛β细胞为维持体内血糖平稳，肝脏组织在胰岛素抵抗下，需分泌胰岛素代偿，导致高胰岛素血症，且需提高内固醇调控组件蛋白1-C(SREBP-1c)及肝X受体(LXR)的呈现。平衡体内脂肪生成基因表达的SREBP-1c，升高脂肪酸合成作用，加速肝细胞内脂肪储存。LXR是新发现的一种肝脏内脂质调节因子，其可与SREBP-1c形成正反馈调节回路，参与调控肝脏内的脂质生成过程。另外，葡萄糖可通过激活转录因子碳水化合物反应原件结合蛋白(ChREBP)表达，促进脂肪酸生物合成。ChREBP亦可促进肝脏内丙酮酸激酶活性，为肝脏游离脂肪酸(Free fattyacids,FFAs)和甘油三酯(Triglyceride，TG)合成提供底物。因此，ChREBP成为中药干预研究的重要靶点[7]。

中医学认为糖尿病属“消渴”范畴，主要病机为气阴两伤、血瘀于络，而脂肪肝属“淤浊”，发病机制乃情志不舒、肝郁气滞、气滞血瘀、湿痰内停、痰瘀痹阻肝络[8]。凡饮食不节，过食肥甘厚腻之品，胃不主受纳，阳明胃肠生热化燥伤津，“脾胃同居中焦”，胃肠燥热太过，则反伤脾气，脾不主运化，气机不行，清阳不升，浊阴不降，清浊互乱于中，痰饮内生，郁滞中焦；日久疾病由太阴发展至厥阴。“肝属木，肾属水，肝为肾之子，母欲受邪，子先代之”，故本病核心病机为“胃热脾困、痰浊瘀结”[9]。针对这一病机，设辛开脾困、苦降胃热、酸化阴精之法，研制运脾化浊方，本方具有清热降气、开郁运脾、化痰活血之功。该方前期经过大量临床疗效观察，可有效改善机体糖、脂代谢及胰岛素抵抗[10-11]。同时研究证实，运用运脾化浊方辛开脾困、苦降胃热、酸化阴精，可有效改善该类患者肝脾CT比值及胰岛素抵抗指数，其安全性较高，临床疗效较好[12]。

本研究通过建立2型糖尿病合并脂肪肝大鼠模型，通过运脾化浊中药单用，西药单用及运脾化浊中药联合西药的干预，阐述运脾化浊方对模型大鼠生化指标的影响、肝脏病理变化，并运用PCR法检测蛋白SREBP-1、ChREBP、PPARa和调节因子LXR的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：选用SPF级SD健康雄性大鼠33只(许可证号NO1103222011002509，北京华阜康公司)，体重(100±20)g。饲养于干净实验室，环境温度为(21±3)℃，相对湿度为60%～80%，自然光照射。保持安静环境，自由饮水进食。

1.1.2 实验药物与试剂：运脾化浊免煎制剂由陕西省中医医院米氏内科内分泌二科提供，陕西省中医医院中药免煎制剂中心配制。链脲佐菌素(Streptozocin)批号：S1030-100mg。DEPC水：1 ml DEPC加入1000 ml双蒸水中，37 ℃饱和24 h后121 ℃湿热灭菌30 min配成1‰ DEPC水。ligo(dT)18 Primers (TaKaRa D511)：首次使用时溶于280 μl DEPC水。1.5 mmol/L Tris-HCl pH 8.8缓冲液(货号Cat#T1010)、1 mmol/L Tris-HCl pH 6.8缓冲液(货号Cat#T1020)、30%的丙烯酰胺制胶液(29∶1)(货号Cat#A1010)、RIPA裂解液(货号P0013B)、TEMED(货号L19S10G98319)、B10FROXX(货号4240GR100)、过硫酸铵(货号A1004)。TWEEN 20(货号：1247ML500)；甘氨酸(货号Cat#G8200)；Tris(货号1115GR500)；氯化钠；抗体PPAR-a(抗体名52KD)；WBSCR(抗体名93KD)；SREBP-1(抗体名122KD)；LXR-A(抗体名50KD)；Gapdh (抗体名37KD)；Goat Anti-Rabbit IgG(二抗)。

1.1.3 实验仪器：离心机(德国Eppendorf-5430)、包埋机(型号KD-BM，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)、病理切片机(型号KD-2258，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)、摊片机(型号KD-P，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)、冻台(型号KD-BL，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)、烤箱(型号PHG-9070A，上海精宏实验设备有限公司)、载玻片及盖玻片(型号10212432C，江苏世泰实验器材有限公司)、正置光学显微镜(型号OLYMPUS CK31，日本奥林巴斯)、成像系统(型号TVO.63XC-MO，明美Mshot)、鼓风式干燥箱(型号101-3，上海锦屏仪器仪表有限公司)、蒸气消毒器(型号YXQG02，山东新华医疗器械股份有限公司)、电热式电热恒温鼓风干燥箱(型号DHG-9145A，上海一恒科技有限公司)。

1.2 实验方法 所有实验大鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表分为两组，除空白组予以0.9%氯化钠溶液外，余组大鼠均予以高糖高脂(成分：10%蔗糖、10%蛋黄、10%猪油、1.5%胆固醇、0.5%胆盐、68%基础饲料混合)饲料喂养1个月后，连续5 d每天给予STZ 40 mg/(kg·d)，腹腔内注射，STZ 7 d后，用血糖仪取尾静脉血测空腹血糖，以连续3 d大鼠空腹血糖值(FBG)高于11.1 mmol/L作为大鼠造模成功标准。成模后继续给予高糖高脂饮食喂养1个月，建立非酒精性脂肪肝大鼠模型。将造模成功的糖尿病大鼠随机分为四组，运脾化浊组、运脾化浊联合二甲双胍组、二甲双胍组、模型组。正常组每日予以0.9%氯化钠溶液灌胃1 ml/只；运脾化浊组每日予以免煎中药灌胃3 ml/只；运脾化浊联合二甲双胍组每天灌胃运脾化浊颗粒2 ml/只、二甲双胍1 ml/只；二甲双胍组每天灌胃3 ml/只。治疗8周结束后3 d处死大鼠，取全血或血清检测生化指标，取肝脏组织进行HE染色观察。

取肝脏组织样品(约30～100 mg)分放入盛有1 ml变性缓冲液(TRIZOL)的手动匀浆器中，在冰浴中充分匀浆。将匀浆液移至1.5 ml的Eppendorf管中，15～30 ℃静置5 min。加入0.2 ml氯仿充分混匀15 s，15～30 ℃下静置2～3 min，4 ℃下12000 r/min离心15 min。取上层水相置于新的EP管内，加入等体积的异丙醇，混匀后静置10 min，4 ℃下12000 r/min离心10 min。弃去上清，加入1 ml的80 %乙醇清洗沉淀，4 ℃下10000 r/min转离心10 min。清洗2次，室温风干沉淀约20 min，用30 μl DEPC水溶解沉淀，取1 μl稀释100倍后测OD260。计算浓度：RNA浓度(μg/μl)=OD260×40×稀释倍数/1000。进行RT反应，制备cDNA模板，再进行实时定量PCR。

2 结 果

2.1 各组大鼠肝脏病理变化 各组大鼠的病理表现，见图1。正常对照组：肝组织结构清晰完整，肝小叶结构正常，以中央静脉为中心向四周放射的肝细胞排列整齐，肝窦清晰可见，肝细胞内无脂滴沉积和炎细胞浸润。模型组：肝细胞结构紊乱，呈中-重度脂肪变性。肝小叶结构不清晰，可见肿胀和气球样变肝细胞，肝细胞索模糊不清，肝窦消失。运脾化浊联合二甲双胍组：大部分肝脏组织恢复正常，肝小叶结构清晰，肝细胞索排列呈放射状，少量小脂滴存在于胞浆内，细胞核位置居中，无炎细胞浸润。二甲双胍组：肝细胞索较整齐，肝细胞轻度肿胀，有大小不等的圆形脂滴空泡存在于胞质内，细胞核不居中。运脾化浊组：肝小叶结构清晰度尚可，肝索排列呈放射状。

图1 各组大鼠肝脏病理表现(HE染色，×10)

2.2 各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、游离脂肪酸(FFA)及甘油三酯(TG)比较 见表1。各组大鼠血清ALT比较，差异有统计学意义(F=15.587，P<0.01)。各组大鼠血清ALT比较，正常对照组较其他各组大鼠ALT无明显升高(P<0.01)，二甲双胍组与运脾化浊联合二甲双胍组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，说明应用二甲双胍比联合运脾化浊方案能更有效改善大鼠ALT水平。各组大鼠血清AST、FFA水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，说明二甲双胍与运脾化浊方在改善大鼠血清AST、FFA效果相当。正常对照组大鼠血清TG与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，运脾化浊联合二甲双胍组比模型组能更有效的改善大鼠TG水平。

表1 各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、游离脂肪酸、甘油三酯比较

2.3 各组大鼠ChREBP、SREBP-1、LXR及PPARa比较 见表2。模型组大鼠ChREBP水平高于正常对照组、运脾化浊联合二甲双胍组、运脾化浊组，差异有统计学意义(均P<0.01)。二甲双胍组ChREBP水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠SREBP-1水平高于运脾化浊联合二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)。运脾化浊联合二甲双胍组、二甲双胍组、运脾化浊组的LSR水平均低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)。运脾化浊联合二甲双胍组的LSR水平低于二甲双胍组、运脾化浊组，差异有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较，运脾化浊联合二甲双胍组、二甲双胍组、运脾化浊组的PPARa水平均高，差异无统计学意义(P>0.05)。运脾化浊联合二甲双胍组的PPARa水平高于二甲双胍组，差异无统计学意义(P>0.05)；运脾化浊联合二甲双胍组的PPARa水平低于运脾化浊组，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠血清ChREBP、SREBP-1、LXR、PPARa蛋白表达比较

3 讨 论

糖尿病合并脂肪肝是临床常见代谢性疾病，胰岛素抵抗是糖尿病与脂肪肝共同发病机制[13]，目前认为脂肪肝发病机制为“二次打击”。胰岛素抵抗引起肝细胞脂质蓄积并诱导机体对内源性损害因子的敏感性增加即为“第一次打击”；在此基础上，被活化因子通过氧化应激与脂质过氧化等反应，损伤肝细胞，促进肝脏炎症反应，导致肝脏细胞坏死或纤维化，即为“二次打击”[14-15]。因此当前治疗本病研究热点之一即调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗。中医药能改善胰岛素抵抗、抑制脂质过氧化，减少氧化应激，调控“二次打击”内环境稳态[16]。

运脾化浊方基于“胃热脾困、痰浊瘀结”病机而立，本方以半夏泻心汤化裁，半夏、干姜、薤白味辛，开散郁滞而化痰浊；脾主升清、胃主降浊，气滞则湿阻，湿滞而化热，热郁生痰，痰瘀互结，久病陈疴[17]，故以黄连、黄芩、郁金、决明子味苦，泻脾胃、肠道之郁热；党参、薏苡仁、甘草味甘，健运脾气，并能预防苦寒药物损伤脾胃[18]。张锡纯言：“苦以甘药佐之，化瘀血而不伤新血，开郁气而不伤正气，其性尤和平也。”山楂酸甘，善消肉食、油腻之积滞，兼有行气化瘀之效，调畅气机而助辛甘诸药消食化痰，白芍敛阴柔肝[19]。有研究证实，白芍有效成分能抗血栓、降脂、降糖、保肝，改善缺血等[20]。丹参、郁金、川芎、三七四味，活血化痰、行气敛阴，既能祛除机体产生之瘀，又能预防体内瘀血的产生。全方以辛开、苦降、酸化三法合用，共奏开郁运脾、清泻郁热、酸化阴精、化痰活血之功。

本实验通过建立糖尿病合并脂肪肝大鼠模型，应用运脾化浊颗粒与盐酸二甲双胍片进行对照研究。结果表明，二甲双胍降酶优于运脾化浊颗粒，两者在降脂及ChREBP方面具有等效性。运脾化浊颗粒与二甲双胍在降低SREBP-1及LXR方面具有协同作用，而在降低PPARa方面优势不显著。