吕松琴，孙溪若，黄 山，段洪芬，施金丽，李晓非，王超男，张 玲，王义娜

（1. 昆明市第三人民医院/云南省传染性疾病临床医学中心，昆明 650041； 2. 上海荣盛生物药业有限公司，上海 201108；3. 东方海洋（北京）医学研究院，北京 100071）

近年来梅毒的发病率逐年增加，在国家法定传染病中位居第3 位，成为严重的公共卫生问题。梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP) 感染引起的性传播疾病[1-2]，早期梅毒传染性最强，随后逐渐减弱；同时早期梅毒的临床治愈率显著高于二、三期梅毒，因此对梅毒的早期诊断和治疗就显得格外重要[3-4]。梅毒的诊断主要依靠实验室检测，尤其是血清学检查[5]。目前使用ELISA 或化学发光法检测梅毒螺旋体特异性抗体[6-7]，但这些方法检测往往需要1～2 h，不适合临床快速筛查。故本研究基于免疫层析和荧光发光平台，利用高活性优势表位嵌合TP 抗原，拟建立一种干式荧光发光快速检测特异性梅毒螺旋体总抗体的检测技术，并对其检测性能进行初步评价。

1 材料与方法

1.1 研究对象 109 例经临床确诊的梅毒患者、44例其他疾病对照组患者和207 例健康体检者血清样本由昆明市第三人民医院检验中心于2020年7月～2021年3月期间收集，保存于-80℃备用。109例经临床确诊的梅毒患者平均年龄43.8±17.2 岁，其中男性44 例，女性65 例；44 例其他疾病对照组患者平均年龄45.7±14.5 岁，其中男性23 例，女性21 例；207 例健康体检者平均年龄43.8±10.9 岁，其中男性85 例，女性122 例。三组性别和年龄比较差异无统计学意义。本研究获得昆明市第三人民医院伦理委员会批准通过。

1.2 仪器与试剂 兔IgG 和羊抗兔IgG 购自北京华信行生物技术有限公司；BSA 购自Sigma 公司；荧光微球购自上海迈普生物科技有限公司；玻璃纤维素垫、硝酸纤维素膜（NC 膜）等耗材购于上海杰一生物技术有限公司；梅毒螺旋体抗体快速试剂国家参考品（批号：370035-201801）购自中国食品药品检定研究院；梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）购自上海科华生物工程股份有限公司。ELx405 深孔板洗板机和ELx-808 吸收光酶标仪购自美国Bio-TeK 公司；AFS-1000 干式荧光免疫分析仪购自广州蓝勃生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TP 抗原的表位分析：采用BIOSUN 生物信息学软件，分别输入TP47，TP17 和TP15 抗原氨基酸序列，然后利用B 细胞表位分析功能，根据表位峰值的高低分析筛选优势表位区段。

1.3.2 高活性优势表位嵌合TP 抗原的制备：根据NCBI 公布的TP 抗原的核酸序列，将TP47，TP17和TP15 三种抗原优势表位区段的核酸序列进行连接获得基因序列，序列合成由中美泰和生物技术有限公司完成。将高活性优势表位嵌合TP 抗原的基因序列连接入pET-28a 载体，构建原核表达质粒pET-TP47-17-15，转化大肠埃希菌BL21，将含有测序正确目的基因的大肠埃希菌菌株进行诱导表达。收集诱导后的菌体，超声波破碎，收集上清液进行Ni 柱纯化，洗脱收集目的蛋白，进行SDS-PAGE电泳鉴定。

1.3.3 干式荧光发光法TP 总抗体检测卡建立：用包被稀释液将高活性优势表位嵌合TP 抗原稀释至最佳包被浓度；将羊抗兔IgG 稀释成最佳包被浓度；用划膜仪将两种包被液分别喷到硝酸纤维素膜上。将已包被的硝酸纤维素膜37℃干燥24 h。将最佳标记浓度的高活性优势表位嵌合TP 抗原与微球按最佳比例进行偶联制得微球标记抗原溶液。将微球标记抗原溶液调整至最佳浓度，以最佳量喷至玻璃纤维垫上制备成TP 微球结合垫。将TP 微球结合垫室温干燥12h。在干燥室内将反应膜、兔IgG 微球结合垫、TP 微球结合垫、样品垫、滤纸等装配成反应板，再用切条机切成试纸条组装成ID 卡，装入铝箔袋内。检测时，阳性样本中的TP 抗体先与固化在玻璃纤维上的荧光微球标记的高活性优势表位嵌合TP 抗原结合形成复合物，并继续向NC 膜层析，通过NC 膜检测线（T 线）时，被包被在NC膜上的高活性优势表位嵌合TP 抗原捕获。仪器显示结果为S/CO 值，S 代表待测样本T 线荧光值和C 线荧光值比值（T/C），CO 为Cut-off值，S/CO值≥1，结果为阳性；S/CO 值＜1，结果为阴性。

1.3.4 临界值（Cut-off值）的确定：选取120 例经酶联免疫法检测确认为TP 抗体阴性的健康体检血清样本，采用本研究检测技术进行检测，分别记录T 线荧光值和C 线荧光值，并计算比值（T /C），然后计算T /C 的平均值（X）和标准差（S），以x±2s为Cut-off值。

1.3.5 干式荧光发光法TP 总抗体检测试剂性能评估：根据国家食品药品监督管理局《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》和中国合格评定国家认可委员会颁布实施的《临床免疫学定性检验程序性能验证指南》，采用梅毒螺旋体抗体快速试剂国家参考品评估阳性符合率、阴性符合率、最低检测限、批内重复性、批间重复性；采用临床样本评估临床敏感度、特异度、阴性预期值、阳性预期值、似然比。梅毒螺旋体抗体快速试剂国家参考品包含10 份阳性参考品（P1～P10），20 份阴性参考品（N1～N20），3 份最低检测限参考品（L1～L3）和1 份重复性参考品（CV）。

1.3.6 临床样本检测

1.3.6.1 酶联免疫法：应用双抗原夹心原理，检测人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体。严格按照试剂盒说明书进行操作，用酶标仪读数，波长450 nm。以S/CO 值≥1.0 为阳性，S/CO 值＜1.0 为阴性。

1.3.6.2 干式荧光发光法：应用双抗原夹心原理，检测人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体。用移液器分别吸取100μl 血清/血浆样本，加入到检测卡上加样孔中。检测卡加样反应15 min 后立即上机检测分析结果并输出报告。

1.4 统计学分析 使用SPSS 19.0 统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料比较采用Kruskal-Wallis 检验，两组间比较采用ANOVA 方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。运用GraphPad Prism 5 软件绘制ROC 曲线，并计算敏感度与特异度。等效性采用Kappa 检验，Kappa 值在0～1 之间，越接近1 说明两种试剂检测结果的一致性越好。

2 结果

2.1 TP 抗原的优势表位筛选 见图1。利用BIOSUN 生物信息学软件分析确定优势表位区段分别为20～170aa（TP47），30～150aa（TP17）和22～80aa（TP15）。

图1 TP 抗原的B 细胞表位分布图

2.2 高活性优势表位嵌合TP抗原的制备 见图2。高活性优势表位嵌合TP 抗原为可溶性表达，Ni 柱纯化后获得纯化抗原，经SDS-PAGE 电泳鉴定，结果显示抗原相对分子量约为37.9kDa。

图2 高活性优势表位嵌合TP 抗原SDS-PAGE 电泳鉴定

2.3 干式荧光发光法TP 总抗体检测技术分析性能评估 通过对120 例经酶联免疫法检测确认为阴性的健康人群血清样本的检测，确定本研究干式荧光发光法TP 抗体检测技术的Cut-off值为0.172。以本研究技术检测梅毒螺旋体抗体快速试剂国家参考品，结果见表1。10 份阳性参考品检测均为阳性，符合率为10/10；20 份阴性参考品检测19 份为阴性，符合率为19/20；三批产品的批内重复性分别为12.00%，12.30%和9.10%，批间重复性为10.90%，均≤20%；3 份最低检测限参考品L1 和L2 检测为阳性，L3 检测为阴性，以上各项均符合国家参考品检测要求。

表1 梅毒螺旋体抗体快速试剂国家参考品检测结果

2.4 临床应用评价

2.4.1 临床样本检测：采用本研究所建立的干式荧光发光法TP 总抗体检测技术对360 例临床样本进行检测，结果见图3。两组间方差分析显示，梅毒患者血清中抗TP 总抗体水平（S/CO：3.942±1.980）与其它疾病对照组和健康对照组之间的差异有统计学意义（P<0.001）；其它疾病对照组（S/CO：0.676±1.169）与健康对照组（S/CO：0.199±0.275）差异无统计学意义（P>0.05）。以临床诊断为金标准，根据ROC 曲线，本研究检测技术诊断梅毒患者的AUC 值为0.986（95% CI：0.975～0.996），S/CO=1 为临界值，检测敏感度为99.08%（95% CI：94.99%～99.98%）（108/109），特异度为94.02%（95% CI：90.37%～96.63%）（236/251）；阳性预测值为87.80%，阴性预测值为99.58%；阳性似然比为16.569，阴性似然比为0.009 8。

图3 干式荧光发光法TP 总抗体检测技术检测性能

2.4.2 干式荧光发光法与酶联免疫法比较：见表2。平行检测360 例临床样本，以酶联免疫法试剂检测结果为参考标准，干式荧光发光法与酶联免疫法的阳性符合率为96.77%（120/124），阴性符合率为98.73%（233/236），总体符合率为98.06%（353/360），两种方法检测结果差异无统计学意义（P>0.05），Kappa指数为0.965，表明两种方法具有高度一致性。

表2 360 例临床样本的平行检测结果

3 讨论

准确快速地检测梅毒对于临床输血安全以及传染病防控具有重要作用。传统的梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验虽然是梅毒螺旋体抗体检测金标准，但由于天然抗原不易获得造成试剂昂贵，限制了其在临床上的应用[6,8]。近年来，采用基因重组技术制备的TP 抗原逐渐代替天然抗原，基于重组抗原建立起来的酶联免疫法、化学发光法、胶体金免疫层析法等检测技术也在临床上得到广泛应用[9-11]。

梅毒螺旋体抗原中TP47，TP17 和TP15 三个脂蛋白具有较强的抗原性。TP47 被认为是梅毒螺旋体丰度最高、免疫性最强和特异度最好的抗原，TP17和TP15 虽然含量较低，但无论在人体内还是动物实验都表明具有很强的免疫原性，单独或联合作为包被抗原表现出较好的敏感度和特异度[12-14]。在本研究中所采用高活性优势表位嵌合TP 抗原是经过B细胞表位分析预测确定TP47，TP17 和TP15 的优势表位区段，并将其串联融合表达为涵盖三种抗原优势表位的嵌合抗原，既保持了抗原的大部分活性表位，又去除了TP47 中和人纤连蛋白存在较高同源性的区段。本研究基于此抗原所建立的干式荧光发光法TP 总抗体快速检测技术检测国家参考品，阳性参考品、阴性参考品、最低检出限和重复性检测结果均符合要求。在临床性能评价中，以临床诊断为金标准，ROC 曲线分析显示本研究技术具有较高检测性能，但特异度有待进一步提高。

本研究的干式荧光发光法TP 总抗体快速检测技术基于免疫层析和荧光发光平台，采用双抗原夹心法原理设计。将该检测技术与临床广泛使用的酶联免疫法检测试剂相比较，具有高等效性。但是本研究检测技术仅需一步检测，可在15 min 内获得结果，简便快捷，检测时间显著缩短，更加适合术前快速检测的要求。与胶体金免疫层析技术相比，敏感度更高，荧光信号通过设备读取，保证结果的准确性、客观性，容易进行实验室质控，避免了人为判断的误差[15]。因此，本研究检测技术是一种敏感度和特异度均高的现场快速简便的检测方法，能够满足临床检测需要。