荣 蓉，古 颖，高 翔，张 磊(首都医科大学附属北京中医医院.检验科;.泌尿外科 ,北京 100010)

前列腺癌是男性常见的生殖系统恶性肿瘤，每年全球发病患者达110 万例，占男性恶性肿瘤的25%[1]。近年来随着我国人口老龄化，前列腺癌的发病率呈逐渐升高的趋势，每年发病例数约14.49万例，死亡例数约5.17 万例[2]。目前前列腺癌的治疗方法包括根治性手术治疗、辅助内分泌治疗及紫杉醇类化疗等，但由于前列腺癌是一种异质性疾病，

许多患者对辅助治疗效果不理想，部分患者在内分泌治疗后出现治疗耐药或抵抗的现象，导致肿瘤复发或转移[3]。因此，探索前列腺癌的发生机制，对于前列腺癌的诊断和治疗意义较大。肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）编码基因位于19p13.3，该基因编码蛋白属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族的一个成员，参与调节正常细胞的极性状态[4]。近年来研究发现，

LKB1 在肺腺癌[5]、卵巢癌[6]等恶性肿瘤中存在表达降低现象，其作为一种抑癌基因，通过抑制下游靶基因AMPKα 的磷酸化激活，抑制肿瘤的发生发展。Rab 鸟嘌呤核苷酸交换因子-5 (Rab guanine nucleotide exchange factor-5，RabEX-5) 蛋白位于质膜，属于小GTPase 家族成员，RabEX-5 可以作为鸟嘌呤-核苷酸交换因子，通过与结合型GDP 作用，使其交换为GTP 激活。据报道，RabEX-5 作为肿瘤促癌基因，在结直肠癌[7]、胃癌[8]等许多癌症中表达上调，并与患者的不良生存预后密切相关。目前，LKB1 及RabEX-5 在前列腺癌中作用机制和临床意义尚不明确，本研究通过研究前列腺癌组织中LKB1 及RabEX-5 的表达，探讨两者在前列腺癌中的临床意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选自2017年2月～2018年2月期间首都医科大学附属北京中医医院收治的92 例前列腺癌患者的资料。本研究已获得首都医科大学附属北京中医医院伦理委员会批准。纳入标准：①由手术获取的癌组织进行病理组织学检查确诊为前列腺癌。②初次诊治，既往无前列腺疾病病史。③临床病理和随访资料齐全，患者对本研究知情同意并签字。排除标准：①并发其它恶性肿瘤史。②伴心肺功能障碍。③并发泌尿生殖系统感染。年龄45～75 岁，平均年龄57.32±7.14 岁；平均前列腺特异抗原（prostate specific antigen，PSA）为26.42±9.41μg/L；肿瘤TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期64 例，Ⅲ期28 例；平均Gleason 评分为8.03±1.15 分；骨转移22 例。以同期首都医科大学附属北京中医医院行手术治疗的80 例前列腺增生患者作为对照，年龄44～73 岁，平均年龄58.31±6.07 岁，患者既往无恶性肿瘤病史，无放化疗等治疗病史，经病理学检查明确为前列腺增生。两组患者年龄之间无明显差异（P>0.05）。患者自术后开始随访，以患者来院复查或电话随访的方式进行随访，随访截止至2021年2月或患者死亡。

1.2 仪器与试剂 PCR 热循环仪（赛默飞公司）。实时荧光定量PCR 仪[美国ABI 公司（ABI7500）]。反转录试剂盒[日本TAKARA 公司（RR037A）]。SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒[上海联迈公司（LM-0051）]。PCR引物由上海生工公司设计合成。

1.3 方法 采用实时荧光定量PCR 检测组织LKB1，RabEX-5 mRNA 的表达水平。各取前列腺癌组织和前列腺增生组织约50mg，剪碎后液氮中研钵研磨，12 000r/min 离心5min 后，Trizol 法提取组织中的RNA，以RNA 作为模板，按照反转录试剂盒说明书反转录为cDNA。然后在实时荧光定量PCR 仪上进行qPCR 反应。引物：LKB1 正向序 列5’-TCCTTGTTTGCTACAGTTTCCTG-3’，反向序列：5’-TCTGGCAGTATTGGGCATTTG-3’，RabEX-5 正向序列5’-TCCAGCAAGTTCAATCAAT GACA-3’，反向序列：5’- TTTTGGCAGGGTTCCT GTAAC-3’，内参基因GAPDH 正向序列5’- ACAG GAACCCTGCCAAAAGTA-3’，反向序列:5’CAACA CTGCTAACCTTAGACACA-3’。总体系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10μl，上游和下游引物各0.5μl，cDNA 1μl，8μl ddH2O。 反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸34s，变性退火延伸共40 个循环。LKB1，RabEX-5 mRNA 的表达水平采用2-ΔΔCt值表示。血清PSA 检测采用定量测定试剂盒(磁微粒化学发光法)进行检测。

1.4 统计学分析 应用SPSS22.0 统计软件进行分析。计量资料以（±s）表示，组间均数比较采用独立样本t检验。Pearson 线性相关分析LKB1 与RabEX-5 mRNA 表达的相关性。Kaplan-Meier 生存模型及Log-Rank 检验分析LKB1，RabEX-5mRNA表达与前列腺癌患者生存预后的关系。多因素COX回归分析影响前列腺癌患者生存预后的危险因素。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌组织和前列腺增生组织中LKB1，RabEX-5 mRNA 表达 前列腺癌组织中LKB1 mRNA 相对表达量为0.373±0.052，低于前列腺增生组织中的1.234±0.268，差异有统计学意义（t=30.181，P=0.000）；前列腺癌组织中RabEX-5 mRNA 相对表达量为1.311±0.374，高于前列腺增生组织中的0.457±0.083，差异有统计学意义（t=20.758，P=0.000）。

2.2 癌组织中LKB1，RabEX-5 mRNA 表达与临床病理特征的关系 见表1。Gleason 评分≥7 分、有骨转移和TNM 分期为Ⅲ期的患者LKB1 mRNA 表达低于Gleason 评分<7 分、无骨转移和TNM 分期为I ～II 期的患者，而RabEX-5 mRNA 表达高于Gleason 评分<7 分、无骨转移、TNM 分期为I ～II期的患者（P<0.05）；不同年龄、PSA 水平的患者LKB1，RabEX-5 mRNA 表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 癌组织中LKB1，RabEX-5 mRNA 表达与临床病理特征的关系（±s，2-ΔΔCt）

表1 癌组织中LKB1，RabEX-5 mRNA 表达与临床病理特征的关系（±s，2-ΔΔCt）

类 别 n LKB1 t 值 P 值 RabEX-5 t 值 P 值年龄（岁） ＜60 48 0.379±0.060 0.884 0.379 1.294±0.180 0.379 0.705≥60 44 0.367±0.047 1.330±0.151 Gleason评分（分） ＜7 35 0.474±0.091 9.965 0.000 1.184±0.198 2.694 0.008≥7 57 0.311±0.042 1.389±0.125 PSA（μg/L） ＜20 37 0.385±0.073 1.453 0.152 1.283±0.154 0.567 0.572≥20 55 0.365±0.050 1.330±0.141骨转移 有 22 0.313±0.066 6.377 0.000 1.457±0.185 2.419 0.018无70 0.392±0.045 1.265±0.104 TNM 分期 I ～II 期 64 0.385±0.039 2.490 0.018 1.258±0.179 4.720 0.000Ⅲ期 28 0.345±0.081 1.432±0.116

2.3 癌组织中LKB1，RabEX-5 mRNA 表达的相关性 见图1。Pearson 相关分析结果表明，前列腺癌组织中LKB1 与RabEX-5 mRNA 表达呈明显负相关（r=-0.402，P=0.000）。

图1 癌组织中LKB1，RabEX-5 mRNA 表达的相关性

2.4 癌组织中LKB1，RabEX-5 mRNA 表达对生存预后影响 见图2。92 例患者随访3～36 个月，平均随访时间为26.36±4.71 个月，随访期间死亡28例，失访3 例。以癌组织中LKB1，RabEX-5 mRNA相对表达量的均数0.373，1.311 为临界值，分为低LKB1 表达组（n=34）和高LKB1 表达组（n=55），低RabEX-5 表 达 组（n=39）和 高RabEX-5 表 达组（n=50）。低LKB1 表达组3年总体生存率为35.29%（12/34），高LKB1 表达组3年总体生存率为89.09%（49/55），低LKB1 表达组患者3年总体生存率明显较低（χ2=55.605，P<0.05）。低RabEX-5 表达组3年总体生存率为89.74%（35/39），高RabEX-5 表达组3年总体生存率为52.00%（26/50），高RabEX-5 表达组患者3年总体生存率明显较低（χ2=29.435，P<0.05）。

图2 癌组织中LKB1，RabEX-5 mRNA 表达对生存预后的影响

2.4 多因素COX 回归分析影响前列腺癌患者生存预后的危险因素 见表2。建立COX 比例风险回归模型（全模回归），以前列腺癌患者生存预后状况为应变量，赋值1=死亡，0=生存，t=生存期。纳入RabEX-5 mRNA 表达、LKB1 mRNA 表达及前述表1 中P＜0.10 的指标。各变量赋值2.4。回归结果表明： Gleason 评分≥7 分、骨转移、TNM 分期为Ⅲ期、LKB1 mRNA 低表达及RabEX-5 mRNA高表达是影响前列腺癌患者生存预后的危险因素（均P<0.05）。

表2 多因素COX 回归分析影响前列腺癌患者生存预后的危险因素

3 讨论

前列腺癌作为男性常见的恶性肿瘤，严重威胁男性的身体健康。近年来虽然前列腺癌的早期筛查使部分患者得以早期诊断和早期治疗[9]，但是临床治疗过程中发现，相当一部分男性人群会在激素治疗或化疗后出现激素抵抗或耐药，最终发展为转移性前列腺癌。此外，部分患者初次诊断时已出现骨、肺等脏器的转移性疾病[10]。因此，深入研究前列腺癌的发生发展中关键的分子标志，对于寻找新的诊断治疗靶点，具有重要的临床意义。

LKB1 是AMPK 途径中高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，可调节细胞能量代谢和细胞分裂[11]。例如，B 细胞中的LKB1 通过充当淋巴细胞代谢和功能的中央调节剂来控制T 细胞分化和生发中心的形成[12]。近年来大量研究发现，在肺癌、乳腺癌等多种人类癌症中经常发生LKB1 的体细胞突变的现象，LKB1 表达失调参与肿瘤发生和癌症发展的机制非常复杂，在不同的肿瘤中具有各种信号传导途径[13]。本研究中，前列腺癌组织中LKB1 的相对表达量较低，可能与调控LKB1 基因表达的微小RNA 表达失常有关。有研究表明，非小细胞肺癌中LKB1 基因存在突变的现象，LKB1 基因突变导致原癌基因KRAS 过度激活，促进肿瘤细胞的无限增殖[14]。近年来发现，肿瘤中LKB1 的表达受到转录后水平的表达调控，如miR-744 能够直接结合并降低LKB1mRNA 3UTR 区，降低mRNA 的稳定性，进而抑制LKB1 基因的表达，促进前列腺癌的恶性进展[15]。本研究结果表明癌组织中LKB1 的低表达促进前列腺癌的发展过程。LKB1 在多种肿瘤中均发挥抑癌基因的功能，前列腺癌中LKB1 基因的表达缺失导致能够诱导参与细胞周期进程的关键蛋白（如cyclin D1，增殖性细胞核抗原等）的水平升高，而导致细胞周期抑制的蛋白（如p21）则降低，导致肿瘤的恶性进展[16]。此外，LKB1 的失活与肿瘤微环境之间的关系已得到越来越多的关注。LKB1基因表达缺失后肿瘤细胞及巨噬细胞等免疫细胞分泌大量细胞因子及趋化因子，重塑免疫微环境中免疫细胞的功能，促进肿瘤进展。如在非小细胞肺癌中，LKB1 失活会促进CXCL7 和IL-6 的分泌，并招募大量嗜中性白细胞肿瘤微环境，抑制T 细胞浸润，促进肿瘤进展[17]。因此，前列腺癌中LKB1 的表达下调可能通过抑制免疫微环境中免疫细胞的功能起重要作用。

RabEX-5 编码基因位于人类7 号染色体，RabEX-5 蛋白与rabaptin-5 蛋白结合形成内吞膜融合所需的复合物，并充当Rab5 的特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子。异常的RabEX-5 表达可能会导致Rab-5 介导的内吞小泡融合过程受阻，从而导致吞噬作用的缺陷。研究数据表明，RabEX-5 可作为癌基因，在结直肠癌和乳腺癌中过表达，参与恶性肿瘤的形成和发展，并可影响肿瘤的生物学行为[7]。然而，目前关于RabEX-5 在前列腺癌中的作用和作用机理报道较少。在本研究中RabEX-5mRNA 表达显著升高，目前其机制尚不清楚，但有学者报道，RabEX-5 受到体内泛素化过程的调控，即RabEX-5受到泛素化连接酶的调控，促进其降解，而肿瘤发生时，负调控RabEX-5 的泛素化连接酶活性降低，导致细胞内RabEX-5 积累，进而导致Rab-5 介导的内吞小泡融合过程受阻，从而导致肿瘤细胞吞噬作用的缺陷，促进肿瘤的进展[18]。此外，本研究结果表明癌组织中RabEX-5 的高表达促进前列腺癌的恶性进展，异常的RabEX-5 高表达会导致Rab-5介导的内吞小泡融合过程受阻，导致吞噬作用的缺陷，作为癌基因参与恶性肿瘤的形成和发展。此外，RabEX-5 能够促进下游靶基因血管内皮生长因子的表达，同时促进肿瘤细胞由G0 期向G1 期的转换，导致肿瘤细胞的过度增殖及转移[19]。本研究发现，癌组织中两者表达呈显著负相关，结合以往研究，RabEX-5 本身作为一种E3 泛素化连接酶，介导的Ras 泛素化，促进Ras 内体定位并抑制ERK 的激活，而LKB1 作为ERK 的下游分子，在RABEX-5 表达上调时其表达也同时受到显著抑制[20]。

本研究预后分析显示LKB1 低表达与RabEX-5高表达患者3年总体生存率明显较低，且多因素COX 回归分析结果证实，癌组织LKB1 低表达与RabEX-5 高表达是影响前列腺癌患者生存预后的危险因素，表明LKB1 与RabEX-5 有可能成为预测前列腺癌患者生存预后的标志物。此外，本研究发现，前列腺癌组织中LKB1 与RabEX-5 mRNA 表达呈明显负相关，分析其原因，可能是两者在肿瘤的发生过程中存在负反馈的调控机制。研究表明，LKB1 的表达缺失促进RAS 的下游通路过度活化，而RabEX-5 对RAS 的泛素化修饰能够促进RAS 的内质网定位，抑制其过度活化[21]，因此RabEX-5能对RAS 的过度活化发挥负反馈的调节功能，但LKB1 与RabEX-5 之间的相互作用关系及临床应用价值有待深入研究。

综上所述，前列腺癌组织中LKB1 低表达，RabEX-5 高表达，两者均与肿瘤分期、Gleason 评分、骨转移有关，两者能够预测前列腺癌患者的生存预后，两者可能参与促进前列腺癌的恶性进展，有可能成为新的肿瘤标志物。