刘永辉 高玉广 卿 洁 谭庆晶 吴 鹏 王天保 韦甜露 刘 泰 陈 炜

(广西中医药大学第一附属医院脑病二区，南宁市 530023，电子邮箱：liuyonghui626@126.com)

急性脑血管疾病患者起病后可以发生多个器官功能损伤，其中胃肠道动力功能障碍是脑缺血再灌注后的常见表现。脑缺血再灌注后肠道的屏障功能受损，消化道溃疡、出血的发生率升高[1]。此外，胃肠功能损伤可加重原有脑部病灶的损伤，并可影响机体各器官功能[2]。目前，脑缺血再灌注后胃肠功能损伤的治疗主要包括改善神经功能、调节和保护胃肠功能，但是大部分患者仍出现神经功能缺损的后遗症，需要长期留置胃管鼻饲，生活质量严重下降，需要长期陪护治疗，这加重了家庭负担。因此，寻找脑缺血再灌注后胃肠功能损伤的有效治疗靶点对改善此病的预后意义重大。近年来，“脑肠同治”以及“脑-肠轴”理论备受关注，故本研究采用运脾豁痰通脑方(自拟方)治疗脑缺血再灌注后胃肠损伤大鼠，探讨该方的神经保护和胃肠功能调节作用，并检测相关组织中生长激素释放肽(Ghrelin)、小窝蛋白1的表达水平以探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠90只，清洁级，体重(440±20)g，20～21月龄，由广西医科大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK桂2009-0002)。所有大鼠在温度为21℃～24℃、湿度为45%～55%的环境中饲养，实验前适应性饲养1周,并随意进食和饮水。

1.2 主要试剂及药物 蛋白免疫印迹实验一抗稀释液(碧云天生物公司，批号：P0023A)，内参Mouse Anti-β-Actin(博士德生物，批号：AC-15)，BeyoECL Plus超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物公司，批号：P0018)，凝胶制备试剂盒(碧云天生物公司，批号：P0012AC)，十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)蛋白上样缓冲液5X(博士德生物，批号：AR1112)，RIPA裂解液 (碧云天生物公司，批号：P0013B)，Ghrelin抗体(Abcam公司，批号：ab95250)，小窝蛋白1抗体(Abcam公司，批号：ab32577)。运脾豁痰通脑方(茯苓12 g、青皮10 g、黄芩15 g、胆南星5 g、石菖蒲15 g、皂荚10 g、地龙10 g、丹参15 g)为江阴天江药业有限公司的免煎颗粒(规格：5 g/包)。

1.3 主要仪器 电子分析天平(OHAUS公司，型号：AR2140)，转印仪(长沙市三环电子设备厂，型号：Mini-PROTEAN)，微型超速冷冻离心机(德国贝克曼库尔特公司，型号：BEA21)。

1.4 分组及模型制备

1.4.1 分组：根据SPSS 17.0软件产生的随机数字进行分组，分为假手术组(30只)和缺血再灌注后胃肠损伤组(60只)。

1.4.2 大鼠大脑中动脉闭塞模型：大鼠术前禁食、禁水12 h。通过腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg)麻醉大鼠，然后将其仰卧位固定。对于缺血再灌注后胃肠损伤组大鼠，分离双侧颈总动脉后使用动脉夹关闭，阻断血流3 min后打开动脉夹使血流再灌注；对于假手术组大鼠，仅单纯分离双侧颈总动脉。

1.4.3 脑缺血再灌注后胃肠损伤模型：大脑中动脉缺血再灌注24 h后，再根据是否出现异常胃肠表现筛选脑缺血再灌注后胃肠损伤大鼠(此时为造模成功)。异常胃肠表现包括大鼠被毛失去光泽，竖毛，大便逐渐变软，逐渐出现食量下降，体重减轻；大便稀软，不成形，甚至溏泻，肛周、尾根部污秽，或干或湿，被毛枯黄或散乱，贴边，扎堆，对外界反应迟缓。缺血再灌注后胃肠损伤组的60只大鼠均出现上述表现，将其采用随机数字表法分为模型组、中药组各30只。

1.5 干预方法 造模成功后自由饮水及进食，3 d后开始进行干预。(1)中药组：以纯净水为溶媒，将运脾豁痰通脑方制成等质量混悬液，按每次380 mL/kg进行灌胃， 1次/d，共14 d。(2)假手术组和模型组：给予灌胃蒸馏水(0.38 mL/kg)， 1次/d，共14 d。灌胃结束后，对各组大鼠进行神经功能缺损评分，然后断头处死大鼠，剥离下丘脑、胃、结肠并迅速放入冻存管内，-196℃液氮中冻存备用。

1.6 观察指标

1.6.1 各组大鼠胃肠功能评估：灌胃期间记录各组大鼠每日饮食量、腹泻的次数，并记录灌胃结束后的体重，以评估大鼠的胃肠功能。

1.6.2 各组大鼠的神经功能缺损评分：使用ZeaLonga 5分制标准[3]。其中，0分为无神经缺失症状，1分为不能伸展对侧前爪，2分为行走时向偏瘫侧转圈，3分为向偏瘫侧倾倒，4分为不能自发行走、意识丧失。

1.6.3 免疫印迹法检测大鼠脑组织的小窝蛋白1表达水平和胃组织的Ghrelin的表达水平：取出大鼠脑、胃组织，分别采用RIPA裂解液进行裂解，匀浆，4℃下12 000 r/min离心5 min，去除沉淀，取上清液。在分光光度计上比色分析，制作标准曲线测出各样本的蛋白浓度。然后上样，电泳，用聚偏二氟乙烯膜60 V进行印迹转移2 h。封闭液封闭1 h后，加入相应的一抗过夜(一抗稀释浓度均为1 ∶100)。次日漂TBS液洗膜3次后，加入二抗(稀释浓度为1 ∶100)。加入发光液，胶片显像，用Image J软件分析图像，实验以β-actin为内参。

1.7 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠胃肠功能指标的比较 与假手术组相比，模型组、中药组大鼠的体重降低、饮食量减少、腹泻次数增加(均P<0.05)；与模型组相比，中药组的体重、饮食量均增加，而腹泻次数减少(均P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠胃肠功能指标的比较(x±s)

2.2 各组大鼠神经功能缺损评分的比较 假手术组无神经功能缺损，模型组和中药组的神经功能缺损评分高于假手术组(P<0.05)，而中药组的评分低于模型组(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠神经功能缺损评分的比较(x±s)

2.3 各组大鼠脑组织中小窝蛋白1的表达和胃组织中Ghrelin的相对表达 模型组和中药组的小窝蛋白1和Ghrelin相对表达水平均高于假手术组 (均P<0.05)；中药组的小窝蛋白1相对表达水平低于模型组，而Ghrelin相对表达水平高于模型组(均P<0.05)。见表3。

表3 3组脑组织小窝蛋白1和胃组织Ghrelin相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

中医认为卒中后胃肠损伤属于“呃逆”“胃脘痛”“虚秘”和“泄泻”。而卒中病为痰浊阻于中焦，升降失常，致脑脉阻滞不通。老年人脾失运化，痰浊内生，内虚生风，风痰阻络，脑窍不开，致使卒中，卒中后胃气失和、气机不畅、运化失调，引起“呃逆”“胃脘痛”“虚秘”“泄泻”。故疏通经络，健脾推行气血，豁痰开窍是主要治疗原则。本研究选用由茯苓、青皮、黄芩、胆南星、石菖蒲、皂荚、地龙、丹参制成的运脾豁痰通脑方，观察其对脑缺血再灌注后胃肠道功能障碍的改善作用。结果显示，与假手术组相比，模型组神经功能缺损评分升高，体重降低、饮食量减少、腹泻次数增加(P<0.05)，提示成功建立脑缺血再灌注后胃肠损伤大鼠模型。给予运脾豁痰通脑方干预后，与模型组相比，中药组的神经功能缺损评分降低，体重和饮食量减少，而腹泻次数减少(P<0.05)。结合运脾豁痰通脑方中，青皮可抑制胃肠道平滑肌收缩[4]，黄芩的主要药物成分除有抗炎作用,还能增强神经细胞的活力,提高神经细胞的存活率,对脑卒中后脑部神经修复起积极作用[5]；胆南星、石菖蒲、皂荚三药均有祛痰开窍作用,皂荚可通络,石菖蒲还有抗抑郁、营养脑部神经的作用,现代药理研究表明,这三药均有针对心脑血管的作用[6-8]；地龙、丹参活血通经,其中丹参有较强的清除自由基的作用,能有效保护胃肠黏膜,且其有效成分丹酚酸B有较好的脑保护作用[9]。因此，运脾豁痰通脑方不仅可以减轻脑缺血再灌注引起的神经功能损伤，还可改善胃肠道功能。

小窝蛋白1是胞膜窖的标志性蛋白，在调节血脑屏障功能中具有重要作用。目前已明确小窝蛋白1与卒中发生后的血脑屏障渗透性密切相关。Choi等[10]发现，大脑中动脉闭塞3 d后大鼠脑组织中小窝蛋白1的表达水平和血脑屏障破坏均达到峰值；认为小窝蛋白1表达水平与缺血引起的血管源性脑水肿密切相关，其在脑缺血损伤期间调节血脑屏障通透性中有重要作用。另有临床研究表明，发病后8 h、24 h、48 h、72 h、1周，脑室出血患者脑脊液中小窝蛋白1水平显著升高，且脑内小窝蛋白1的表达与颅脑损伤的严重程度有关，其或可作为颅脑损伤疾病预后的指标[11]。本研究结果也显示，脑缺血再灌注后胃肠道损伤的大鼠脑组织的小窝蛋白1表达水平升高；而给予运脾豁痰通脑方干预后，中药组大鼠脑组织的小窝蛋白1表达水平低于模型组(P<0.05)。有学者发现，降低小窝蛋白1的表达可改善脑缺血再灌注损伤大鼠的血脑屏障[12]。因此，推测运脾豁痰通脑方可能通过调节小窝蛋白1的表达来改善血脑屏障的功能，从而减轻大鼠的脑缺血再灌注损伤。

Ghrelin是主要由胃基底部黏膜层X/A样细胞分泌的一种新型脑肠肽激素，其结构与胃动素相似，还可广泛表达于胃黏膜之外的器官或组织，如脑、肠等。除了促进生长激素分泌，Ghrelin还具有促进食欲和进食活动、促进胃酸分泌和胃蠕动等生理作用[13]。有研究显示，外源性Ghrelin可以改善局灶性脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺损，缩小梗死面积，并提高皮质层神经元的存活率[14-15]。本研究中，模型组大鼠胃动力学降低的同时胃组织Ghrelin水平升高。有学者也发现，脑缺血大鼠在脑缺血早期胃动力学显著降低而血清Ghrelin水平升高，这可以解释为早期缺血阶段的代偿反应[16]。本研究中，给予运脾豁痰通脑方干预后，中药组大鼠脑组织的Ghrelin表达水平高于模型组(P<0.05)，这表明运脾豁痰通脑方可上调Ghrelin水平。血清Ghrelin的上调可预防脑损伤并增加肠道蠕动，从而减少胃黏膜屏障的损伤[17]。此外，Ghrelin还可通过调节活性氧、酶活性和线粒体基因表达来抑制细胞凋亡，在脑缺血再灌注损伤中具有显著的细胞保护效应[18]。因此，我们推测运脾豁痰通脑方通过上调Ghrelin水平，从而调节活性氧、酶活性和线粒体基因表达来抑制细胞凋亡，进而增加肠道蠕动，并减轻血脑屏障的破坏和脑缺血再灌注损伤。

综上所述，运脾豁痰通脑方不仅可以减轻脑缺血再灌注后胃肠损伤大鼠的神经功能损伤，还可改善胃肠道功能，其可能通过下调小窝蛋白1、上调Ghrelin的表达来发挥治疗作用。