刘义庆，谢 荣，胡思前，2*

（1.江汉大学化学与环境工程学院，湖北武汉 430056；2.湖北省健康代糖产品企校联合创新中心，湖北武汉 430056）

板栗是壳斗科栗属植物，分布于世界各地。板栗营养物质丰富，含有淀粉、多糖、蛋白质、脂肪、多种维生素和微量元素，特别是维生素C（VC）、维生素B1（VB1）和胡萝卜素的含量比一般干果要高[1]。板栗果实有较高的医疗保健价值，中医认为，板栗有养胃、健脾、补肾、壮腰、强筋、活血、止血、散瘀、消肿等功效，特别是对老年人有很好的滋补效能。板栗对高血压、冠心病、动脉粥样硬化等也具有较好的防治作用，故有“干果之王”的美誉，在国外被称为“人参果”[2-3]。我国是世界板栗第一生产大国，板栗产量居世界第一。2019 年世界板栗产量2.40×106t，我国板栗总产量2.20×106t，约占世界板栗产量的90%[4]。湖北罗田板栗为湖北优质板栗品种，栗壳、板栗果皮为板栗副产品，多废弃不用。近年来对板栗壳的综合利用已引起人们的关注，板栗壳提取物具有抗氧化、抑菌、降血糖、降血脂、抗肿瘤等生理活性，还可应用在净化水质、食用菌生产、食品生产、印染工业等方面[5-8]。

国内学者对板栗果皮的成分与综合利用进行了探索，如刘治梅[9]、张捷莉等[10]分别以碳酸钠溶液和50%乙醇为溶剂提取板栗果皮棕色素，初步试验了棕色素的性质。臧延青等[11]、陈龙等[12]分别以河南信阳和山东沂蒙板栗果皮为原料，以乙醇与水混合为提取溶剂，采用正交实验法优化了板栗果皮色素的提取工艺。卢川等[13]发现板栗果皮乙醇提取物含有黄酮类、多酚类、甾类、脂肪酸等化学成分。綦菁华等[14]发现板栗果皮中酚类组分具有抗氧化活性。夏姣云等[15]则将板栗果皮应用于对水溶液中镉离子和铅离子的吸附。目前还没有以丙酮与水混合作为提取剂提取板栗果皮中有效成分的报道。

鉴于此，本文以湖北罗田板栗作为原料，对板栗果皮的提取溶剂进行了系统研究，应用化学分析的方法确定了提取物的主要化学成分，并采用正交试验法对板栗果皮中缩合鞣质的提取工艺进行了优化，为进一步开发利用板栗果皮奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜板栗，购自湖北罗田，去壳、剥皮并将板栗果皮粉碎，置于5 ℃冰箱中冷藏备用。

丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、溴、明胶、氯化高铁、生物碱、钨酸钠、磷钼酸、无水碳酸钠，国药集团化学试剂有限公司，分析纯。没食子酸标准品（≥99.5%，CAS：149-91-7），阿拉丁试剂（上海）有限公司。

福林酚试剂的配制：钨酸钠50 g，磷钼酸10 g 溶于含375 mL 水的烧瓶中，再加入25 mL、85%磷酸，水浴回流2 h，冷却后在500 mL 容量瓶中定容并保存。

1.2 仪器与设备

721 分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；85-1恒温水浴锅，国华电器有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；ST-02A 多功能粉碎机，永鑫市帅通工具有限公司；RE-S2 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 板栗果皮中色素提取及其化学成分的鉴定

准确称取1.000 0 g 板栗果皮粉末于带塞锥形瓶中，加入20 mL、50%丙酮-水溶液，密封，浸提3 h。过滤，减压蒸馏浓缩，得板栗色素提取液。

取适量提取液，加入等体积乙酸乙酯进行萃取。各取四份乙酸乙酯萃取液和经过乙酸乙酯萃取后的水相部分溶液，分别做三氯化铁显色反应、溴水反应、明胶氯化钠反应和生物碱反应试验，以确定色素的物质类别。

1.3.2 没食子酸标准曲线的绘制

采用福林酚法：取0.500 0 g 没食子酸标准品溶于5 mL 乙醇，用水定容至100 mL。分别准确移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 上述溶液于10 mL 比色管中，蒸馏水定容，制成没食子酸标准品溶液，浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L。分别准确移取标准品溶液1.0 mL 加入10 mL 比色管中，再加入6 mL 蒸馏水进行混合后，再加入0.5 mL 的福林酚试剂，混匀后静置5 min 后，加入1.5 mL、20%Na2CO3溶液，混合后定容至10 mL，20 ℃避光放置2 h 后，用蒸馏水作空白对照，在760 nm 下测定其吸光值A。以没食子酸的浓度为X 轴，吸光值为Y 轴，绘制标准曲线，并计算回归方程。

1.3.3 板栗皮缩合鞣质的提取率

（1）板栗果皮中缩合鞣质的总量测定

称取板栗果皮粉末样品0.500 0 g，置于25 mL 带塞比色管中，加入15 mL 提取溶剂，静置提取3 h，重复提取4～5 次至缩合鞣质提取完全，合并提取液，定容至100.0 mL，取适量提取液于10 mL 比色管中，按1.3.2 方法测定10 mL 比色管中缩合鞣质的浓度，并计算0.500 0 g 板栗果皮提取液含缩合鞣质的总量。计算公式见式（1）。

式中，m0-缩合鞣质总量，mg；c0-没食子酸的浓度，mg/mL；V0-定容的体积，mL；n0-稀释倍数。

（2）提取率的计算

按1.4 及1.5 设计的方法提取缩合鞣质，按1.3.2 定量方法测定缩合鞣质浓度和提取量，按公式（2）计算提取率。

式中，y-提取率；m-提取液缩合鞣质的质量，mg；c-提取液中的浓度，mg/mL；V-定容的体积，mL；n-稀释倍数。

1.4 单因素试验

取25 mL 比色管，各加0.5 g 板栗果皮粉末，每组3份，加入溶剂提取板栗果皮色素，分别试验不同溶剂、混合溶剂的体积百分比浓度、提取温度、提取时间、料液比、提取次数对板栗果皮色素提取效率的影响。溶剂考察甲醇、乙醇、丙酮；丙酮-水混合溶剂考察的丙酮体积百分比浓度分别为20%、40%、60%、80%、100%。板栗果皮色素稳定性试验显示，板栗果皮色素在60 ℃以下稳定[10]，故提取温度分别考察20、30、40、50、60 ℃。提时间分别考察15、30、45、60、75 min，料液比分别考察1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）。取2 mL 提取液于10 mL 比色管中，加入福林酚法显色剂和碳酸钠溶液，定容后静置，测760 nm 下的吸光值，计算缩合鞣质提取率，分析各因素对缩合鞣质提取效率的影响。

1.5 正交试验

综合考虑提取溶剂的体积百分比浓度、料液比、提取温度、提取时间这几个因素对板栗果皮缩合鞣质提取率的影响，每个因素选取3 个水平进行正交试验，从而探索板栗果皮中提取缩合鞣质的最佳条件。试验因素与水平设计见表1。

表1 提取正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of extraction orthogonal test

1.6 数据处理

数据采用Excel 2010 处理并作图。

2 结果与分析

2.1 板栗果皮色素的化学成分鉴定

试验了板栗果皮色素提取液的三氯化铁显色反应、溴水反应、明胶氯化钠反应和生物碱反应试验，实验结果如表2 所示。

表2 板栗果皮色素的化学鉴定结果Table 2 Chemical identification results of chestnut peel pigment

表2 显示，有机相乙酸乙酯萃取部分和水相部分均能使三氯化铁变成灰绿色或黑色，说明板栗果皮色素提取液含有邻二酚羟基化合物，而且能使溴水变色，能与明胶氯化钠反应产生沉淀，能沉淀生物碱，因此判断该提取物中含有缩合鞣质。鞣质有低缩合鞣质和多聚缩合鞣质之分，低缩合鞣质存在于乙酸乙酯中，多聚缩合鞣质存在于水中[16]。

2.2 没食子酸标准曲线

以没食子酸标准品配制系列浓度标准溶液，采用福林酚法测定溶液吸光度值，得回归方程式为y=1.141x-0.006，R2=0.999 0。

2.3 单因素试验

2.3.1 不同溶剂对板栗果皮缩合鞣质提取效率的影响

在同样的实验条件下研究了3 种提取剂对板栗果皮中缩合鞣质提取效率的影响，实验结果显示，甲醇、乙醇、丙酮三种提取剂的提取效率分别为31.3%、35.3%、41.2%。由此可见，丙酮浸提果皮色素提取效果最好，乙醇次之，甲醇最差。因此，选择丙酮作为提取溶剂。

2.3.2 溶剂浓度对板栗果皮缩合鞣质提取效率的影响

选用不同浓度的丙酮为溶剂提取板栗果皮缩合鞣质类色素，实验结果如图1（见下页）所示。

图1 溶剂浓度对板栗果皮鞣质提取效率的影响Fig.1 Effect of solvent concentration on extraction efficiency of tannins

由图1 可看出，随着溶剂丙酮浓度的增加，缩合鞣质的提取量先增大后减小，丙酮的最佳浓度为40%～60%。进一步实验比较丙酮浓度为40%、50%和60%时的提取率，发现40%、50%丙酮的提取率接近，所以选择40%丙酮为最佳的提取溶剂。

2.3.3 温度对板栗果皮缩合鞣质提取效果的影响

前期试验得出，30 ℃以下板栗果皮缩合鞣质的提取效率不高，由图2 知，30～40 ℃间随温度升高提取效率不断增加，40～60 ℃缩合鞣质的提取率稳定，以40 ℃时为最好。故从提取率和节约资源两方面考虑，40 ℃为提取板栗果皮中缩合鞣质的最佳温度。

图2 温度对板栗果皮缩合鞣质提取效果的影响Fig.2 Effect of temperature on extraction efficiency of tannins

2.3.4 提取时间对板栗果皮缩合鞣质提取效果的影响

由图3 可看出，在15～60 min 范围内，提取时间越长，缩合鞣质提取率越高，但当提取时间达到60 min 时，缩合鞣质提取率达到最大且基本不变，因此，以60 min为最佳提取时间。

图3 提取时间对板栗果皮鞣质浸提效果的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of tannins

2.3.5 料液比对板栗果皮缩合鞣质提取效果的影响

由图4 可看出，随着提取液量的增加，提取鞣质的提取率先升高后趋于平稳，当料液比为1∶15 时，提取率最高，此时板栗果皮中的缩合鞣质已经基本提取完全，此时再增加提取液的量，缩合鞣质提取率不会继续增加，因此，提取板栗果皮缩合鞣质的最佳料液比为1∶15。

图4 料液比对板栗果皮鞣质浸提效果的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction efficiency of tannins

2.4 正交试验

由正交试验表4 可知，四因素影响大小顺序为C＞A≈D＞B，因此，提取时间对板栗缩合鞣质提取效率的影响最大，其次是丙酮浓度和料液比，它们对缩合鞣质提取效率的影响接近，料液比的影响稍低于丙酮浓度的，提取温度对提取效率的影响最小，极差分析最佳组合为A1B2C2D2。即丙酮浓度为40%，料液比为1∶20，提取温度为40 ℃，提取时间为60 min。

2.7 验证试验

为了进一步验证试验结果的准确性，用分析天平称取1.0 g 板栗粉末于25 mL 比色管中，分别加入20 mL 的体积分数为40%的丙酮，40 ℃水浴加热提取60 min，取适量于10 mL 比色管中，测得提取率为63.5%，均高于正交试验其他组。

3 结论

我国是世界板栗第一生产大国，湖北省是国家重要的板栗出产地，罗田板栗为湖北优质板栗品种。板栗营养物质丰富，有较高的医疗保健价值。板栗果皮为板栗副产品，多废弃不用。本实验对板栗果皮成分进行化学分析，采用正交实验优化板栗果皮提取工艺，为进一步开发利用板栗果皮奠定了坚实的基础，对提高板栗综合利用价值具有重大意义。

以体积分数为40%的丙酮为溶剂提取的板栗果皮色素经三氯化铁反应、溴水反应、明胶氯化钠反应、生物碱反应等一系列定性实验证明为缩合鞣质，经乙酸乙酯萃取后，有机相为低聚缩合鞣质，水相为多聚缩合鞣质。经单因素及正交试验发现，体积分数为40%的丙酮是提取板栗果皮缩合鞣质的最佳溶剂，最佳提取工艺为提取剂丙酮的体积分数40%，料液比1∶20，提取温度40 ℃，提取时间为60 min，提取率可达63.5%。