李 希，王 曦，周胜花，吴苏君，李春艳，张 丽，郭慧慧，薛丽娜，王宏浩

（山西农业大学动物科学学院，山西太原030032）

作为卵母细胞中数量最多且功能最复杂的细胞器结构，线粒体在卵母细胞发生发育过程中有着不可替代的作用。大多数动物物种的线粒体都遵循母性遗传，因为精子在进入卵母细胞后，其线粒体很快被自噬降解，因此，卵母细胞是个体整个线粒体基因组的唯一来源。作为下一代线粒体基因组的来源，除了保持线粒体基因组的完整模板代代相传，线粒体在卵母细胞中的作用更为复杂和多效[1]。线粒体除了产生三磷酸腺苷（ATP），给细胞提供能量[2]，还参与钙稳态、细胞周期、细胞凋亡、天然免疫信号通路等多种生物过程的调控[3]。

研究发现，在卵母细胞成熟早期，糖酵解有一个阻滞期，直到桑葚胚向囊胚期转变时才会缓解[4]，因此，卵母细胞线粒体是卵母细胞及早期胚胎所需能量的最直接来源。卵母细胞对线粒体ATP 的依赖引发了人们对线粒体越来越多的关注[5]，可以说线粒体是卵母细胞质量或后续发育力的主要决定因素。黄睿[6]研究发现，在卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中，线粒体的数量和形态发生着动态变化，线粒体的这种变化特性直接影响卵母细胞成熟和胚胎发育的质量，线粒体形态和拷贝数的异常甚至会导致胚胎发育障碍。因此，线粒体的质量和数量决定着卵母细胞减数分裂的能力、受精能力及受精后激活的能力或新胚胎持续发育的能力。

笔者就线粒体功能与卵母细胞成熟发育的相关文献进行综述，以了解线粒体功能及线粒体营养剂对卵母细胞成熟发育质量的影响以及改善线粒体功能和提高卵母细胞质量的途径。

1 线粒体结构与功能

1.1 线粒体结构

线粒体被誉为真核细胞的能量工厂，是细胞产能以及进行三羧酸循环、脂肪酸代谢、氧化磷酸化等重要生理生化反应的场所[7]。其具有特殊的双层膜结构，其内膜相对于细胞器本身向内高度折叠，形成了大小和形状各异的凹陷叫做嵴。嵴上附着有大量功能蛋白，如氧化磷酸化的相关蛋白、钙离子转运蛋白等[8]，还附着有独立的遗传物质线粒体DNA（mtDNA）。线粒体DNA 呈双链闭合环状，长度一般为几万至数十万碱基对，人类 mtDNA[9]长度约为16.51 kb，无内含子，编码区共37 个基因，编码自身转录翻译所需的22 种tRNA、2 种rRNA 以及氧化磷酸化所需的酶复合物亚单位的13 种蛋白多肽[10]，包括 I、III、IV 和 V 亚基的组成部分。mtDNA 能够进行独立复制、转录和翻译，但相关的转录因子及酶基因由细胞核基因组控制[11]。

1.2 线粒体功能

线粒体的主要功能就是通过呼吸链和氧化磷酸化的偶联来产生能量并供给细胞[12]。卵母细胞成熟和发育的每一个步骤，诸如纺锤体形成、染色单体分离和卵母细胞受精等，都需要大量的能量来供给[13]。因此，卵母细胞线粒体所产生的ATP 量直接影响其成熟质量和受精结果。

线粒体还可以和内质网协同作用，共同调节卵母细胞成熟发育过程中细胞内钙离子浓度的稳态。细胞内Ca2+稳态对于卵母细胞减数分裂和受精过程至关重要，过高浓度的Ca2+会抑制ATP 的生成，促进活性氧产生[14]。线粒体在卵母细胞成熟期间逐渐靠近内质网，并与内质网形成紧密联系的微区，内质网储存的钙离子通过微区进入线粒体[15]，增强线粒体氧化磷酸化能力[16]。线粒体还调节受精过程中的钙振荡，通过增加钙振荡来诱发氧化磷酸化产生ATP，这对胚胎发育至关重要[17]。所有的ATP 都是由线粒体氧化磷酸化过程产生，还会产生活性氧（ROS）。少量的ROS 对于细胞正常生理功能和细胞代谢调节具有重要作用。

2 线粒体结构与功能对卵母细胞成熟和发育质量的影响

2.1 线粒体DNA 及拷贝数对卵母细胞成熟和发育的影响

在不同组织不同类型细胞中，线粒体数量差异很大，具体数量由其代谢活性决定。在卵母细胞、肌肉细胞和神经元细胞等高能源需求的细胞中，有着最大数量线粒体和线粒体DNA 拷贝数。在卵母细胞成熟过程中，线粒体数量由原始生殖细胞中的不足10 个，至成熟的卵细胞中增加到10 万个以上[18]。线粒体DNA 拷贝数在成熟过程中也在不断增加，从原始生殖细胞的2 000 个拷贝，到发育至成熟的卵母细胞则有15 万～25 万个拷贝[19]。

成熟卵母细胞中的线粒体拷贝数明显增多，这与支持受精及胚胎发育密切相关，虽然有证据显示，线粒体DNA 拷贝数量的改变不影响卵母细胞成熟，但会影响卵母细胞受精的能力[20]。SANTOS 等[21]在体外受精研究中发现，正常受精卵母细胞内线粒体DNA 拷贝数明显要高于受精失败及退化的卵母细胞，同时正常发育受精卵内线粒体DNA 拷贝数明显高于发育受阻的受精卵，提示线粒体DNA 拷贝数降低是卵母细胞受精失败和体外胚胎早期发育受阻的重要原因。MAY-PANLOUP 等[22]研究表明，尽管较低线粒体拷贝数小鼠的卵母细胞能够支持受精和着床前胚胎发育，但植入后情况不佳。WAI 等[23]对小鼠线粒体拷贝数的测定结果表明，胚胎植入后的发育卵母细胞线粒体拷贝数所需阈值40 000～50 000 个。不同物种支持卵母细胞成熟发育的线粒体拷贝数阈值存在较大差异，线粒体拷贝数太少会阻碍能量代谢和胚胎质量，太多了也会损害细胞功能。

另外，线粒体DNA 因为没有组蛋白的保护，容易发生突变或受损，而其又无内含子，少量的碱基突变就会引发其重要功能区基因的表达和活性，从而造成质量下降及胚胎发育障碍。

2.2 线粒体结构变化对卵母细胞成熟和发育的影响

在卵母细胞成熟和发育过程中，为了更好适应能量需求，线粒体形态呈动态变化且有独特的超微结构。在成熟卵母细胞中，线粒体呈球形结构，基质致密，仅有少量嵴。到受精卵和2 细胞期，线粒体呈哑铃状，嵴集中分布。接着从4 细胞期到桑葚胚，线粒体结构逐渐变长，呈现横嵴[24]。研究发现，在猪卵母细胞成熟过程中，线粒体内嵴不断伸长，甚至与内质网连接构成线粒体—内质网集合体，基质电子密度逐渐降低[25]。KACINSKIS 等[26]在奶牛上的研究和MONDADORI 等[27]在北非野牛上的研究结果也类似。

线粒体通过持续的融合和分裂来调控自身的形态、数量、分布和功能等[28]。线粒体形态在管状和球状结构间来回变换[29]。融合初期，2 个线粒体相互靠近，融合调控蛋白Mfn1/Mfn2 彼此结合，使外膜开始逐渐融合[30]。随后，在融合蛋白OPA1 的作用下，实现了线粒体的内膜融合[31]，2 个线粒体合二为一。当分裂开始时，胞质中的发动蛋白相关蛋白（Drp1）与外膜表面上的分裂因子Fis1、Mff、Mid49和Mid51 等蛋白结合，导致内外膜的断裂[32]。线粒体融合和分裂的异常常伴随着线粒体结构功能的变化。有试验[31]证明，卵母细胞线粒体融合与分裂失衡的小鼠会出现线粒体结构异常，使得线粒体膜电位下降、ATP 生成不足、卵母细胞纺锤体的组装出现问题，导致染色体排列异常和非整倍体增加，从而影响卵母细胞质量。

2.3 线粒体的空间变化对卵母细胞成熟和发育的影响

在卵母细胞成熟和发育过程中，线粒体会根据细胞对局部能量的需求不断改变其排列布局，以保持其功能状态贯穿整个细胞周期以及其他重要的过程。线粒体在未成熟卵母细胞中主要聚集在生发泡周围，为转录和翻译提供能量。随着卵母细胞生长，线粒体会逐渐外迁并增殖，为蛋白质的合成以及分泌提供能量[33]。在成熟过程中，线粒体则主要位于纺锤体周围，为微管活动和细胞分裂供能[34]。在卵母细胞成熟发育过程中线粒体分布的这种阶段特异性，保证了线粒体在不同发育阶段能更好地发挥作用，以适应能量代谢需求。

刘姗等[35]研究发现，线粒体在成熟前小鼠卵母细胞中分布相对均匀，但在GVBD 后，随着纺锤体的形成，第1 个减数分裂中期线粒体在纺锤体周围与内质网形成集合体；排出第一极体后，线粒体在细胞质周围重新分布，为卵母细胞受精做准备。汤连升等[36]研究发现，GV 期山羊卵母细胞中线粒体均匀分散在胞质中，而后逐步由皮质层移向染色质周围，到MⅡ期密集分布在染色体的周围。纺锤体形成和极体形成过程中线粒体这些分布的变化与ATP 水平的增加有关，进一步证明线粒体活动是在满足卵母细胞成熟发育不同时期的代谢需求。

在卵母细胞体外成熟的研究中也发现这种分布变化。体外成熟之前的卵母细胞需要颗粒细胞的支持，线粒体多分布于细胞质的周边，体外成熟以后，线粒体主要分布于细胞质中央[34]。BREVINI 等[37]研究发现，线粒体在未成熟卵母细胞和发育潜能较低的体外成熟卵母细胞中呈现周边分布，而在发育潜能较高的体外成熟卵母细胞中线粒体多呈均匀分布。

2.4 线粒体膜电位变化对卵母细胞成熟和发育的影响

许多线粒体功能包括三磷酸腺苷的产生、蛋白质的输入和脂质生物的形成，都依赖于膜电位的维持[38]。膜电位的正常对卵母细胞成熟和发育也十分重要，卵母细胞中线粒体膜电位异常会造成线粒体功能障碍，继而引发胚胎发育障碍。线粒体膜内外的电位差（ΔΨm）大，又称为线粒体极性高。使用活细胞成像，观察到在小鼠卵母细胞中，ΔΨm 随着卵母细胞成熟的时间进程而增加，显示第1 次减数分裂纺锤体的附近相对于其他地区的细胞质，线粒体的ΔΨm 增加，到MⅡ期卵胞质周边ΔΨm 极高，受精后极性瞬间消失[39]。当线粒体功能受损或下降时，线粒体膜电位会降低，玻璃化会降低小鼠卵母细胞线粒体膜电位[40]，玻璃化小鼠受精卵发育潜能较差。

2.5 ROS 对卵母细胞成熟和发育的影响

线粒体的氧化磷酸化过程不仅产生ATP，同时也会产生活性氧（ROS），而且细胞内95%的活性氧自由基都来自线粒体，是呼吸链中分子氧接受漏电子后还原形成的细胞正常代谢产物。在正常生理状态下，细胞内抗氧化能力与活性氧水平处于动态平衡状态，细胞内ROS 的水平始终维持在一个较低的生理范围并调节细胞代谢和信号转导等，对维持细胞正常生理功能具有重要作用。一旦这种平衡被打破，细胞ROS 水平升高，高浓度的ROS 就会诱发氧化应激，损伤线粒体DNA，造成线粒体DNA 突变或缺失，ATP 生成减少，线粒体膜上离子交换通道破坏，膜电位消失等[41]，从多个方面影响卵母细胞成熟和发育质量，造成卵母细胞受精率下降、胚胎发育受阻、甚至植入后成活率降低。

3 线粒体营养剂及其提高线粒体功能的研究

卵母细胞线粒体结构和功能的异常均会导致卵母细胞代谢受损和发育质量下降，因此，可以通过提高卵母细胞线粒体功能和补充正常线粒体来改善卵母细胞成熟和发育质量。补充线粒体也称作线粒体替代，是指将体外分离的线粒体供体，通过显微注射法注入卵母细胞，促进卵母细胞成熟并提高受精发育能力。方法有生发泡移植、纺锤体移植、原核移植、极体移植和线粒体移植。由于这些技术涉及伦理问题，目前已经被禁止。而提高线粒体质量可以通过补充线粒体营养剂来实现。已有研究证实，补充线粒体营养剂可以成功缓解与线粒体缺陷相关的各种疾病，且对母亲和胎儿都是安全的。

线粒体营养剂是指能够促进线粒体产生能量，能够靶向性保护线粒体结构功能完整或促进线粒体功能发挥的一类生物或化学化合物。这些营养剂可以是线粒体的组成成分或者代谢物，也可以是某些天然化合物[42]，主要包括 L- 肉碱、α- 硫辛酸、辅酶Q10、白藜芦醇、褪黑素、肌酸、胆碱、磷脂、谷胱甘肽和生长激素等。它们具有改善或增强线粒体功能的重要作用，包括维持线粒体与细胞核、其他细胞器之间的信息交流[43]；促进功能线粒体的生成和损伤线粒体的吞噬降解；直接或者诱导激活抗氧化酶系统，清除自由基，降低线粒体结构的氧化；修复损伤的线粒体结构等[44]。

研究已证实，在衰老小鼠膳食中补充α-硫辛酸（作为线粒体代谢中重要的辅酶），可以提高线粒体的活动[45]。白藜芦醇作为一种抗氧化剂，在超氧化物歧化酶和过氧化氢酶这2 种重要的抗氧化酶的转录中起着重要的作用，通过激活各种线粒体代谢靶点如PGC-1、SIRT1、amp- 激酶和抗氧化酶来发挥作用[46]。对中年小鼠的研究表明，短时间注射白藜芦醇，可以有效改善氧化应激引起的输卵管内衰老卵母细胞的破碎和死亡[47]。TAKEO 等[48]研究证明，在卵母细胞体外成熟液中添加一定浓度的白藜芦醇，可以通过改善线粒体数量和质量来改善卵母细胞的质量。在猪的研究中同样证明，白藜芦醇可以改善猪卵母细胞的线粒体性能和发育能力[49]。研究表明，在小鼠卵母细胞培养液中补充L- 肉碱（一种重要的脂肪酸β 氧化抗氧化剂），可提高玻璃化卵母细胞体外成熟后减数分裂纺锤体配置和线粒体分布[50]。辅酶Q10 作为电子传递链的重要组成单元，膳食补充辅酶Q10 可降低人卵母细胞的非整倍体率，逆转人卵母细胞质量和数量随年龄的下降[51]。在衰老小鼠饮食中，添加辅酶Q10 能够改善卵泡减少和增加产仔数。生长激素是一种多效性激素，影响多种生理功能，包括碳水化合物代谢、脂质代谢和免疫反应等[52]。有研究表明，生长激素还可以通过上调自身受体和增强线粒体活动来改善卵母细胞质量。研究发现，对低排卵反应妇女使用生长激素治疗后，增加了卵巢对外源性促性腺激素的敏感性，增加了MⅡ期卵母细胞的复苏受精率、优质胚胎数和妊娠率[53]。研究发现，生长激素调节卵母细胞线粒体功能的效果与其剂量有关，即使用不同生长激素注射剂量作用于老年不孕雌鼠，发现高剂量生长激素能够明显增加总卵母细胞数和超数排卵获得的卵母细胞数；中等剂量生长激素可改善卵母细胞线粒体功能而不增加线粒体数量[54]。

归纳起来，线粒体营养剂的作用机理有5 个方面。（1）提高线粒体酶的浓度，修复线粒体功能；（2）清除自由基，减少氧化产物的堆积；（3）修复线粒体膜；（4）诱导二相酶，增强细胞抗氧化防护；（5）激活线粒体生成[55]。

4 小结

了解线粒体在卵母细胞成熟过程中的动态分布变化，有助于揭示卵母细胞发生发育成熟机制及线粒体作用机制，更好地改善线粒体功能和卵母细胞发展潜力。利用线粒体营养剂来提高卵母细胞线粒体功能和卵母细胞质量是一种安全有效的途径。其机制可能是增加了用于染色体分离的能量。线粒体营养剂对预防及治疗线粒体相关疾病也具有重要意义，相对于线粒体替代，线粒体营养剂不存在异质性问题。目前各种营养剂调节线粒体功能的确切机制仍不清楚，而且发挥最佳功能的使用剂量有待进一步深入研究。