于子优 蔡宜佐 李伟 张文杰

【提要】 创伤、感染、肿瘤等各种原因导致的大面积皮肤及软组织缺损是整形外科的常见病，皮肤扩张、皮瓣移植、脂肪组织填充等是组织缺损修复的常用技术手段，而这些技术在应用过程中仍然存在组织扩张速度缓慢、扩张皮肤回缩、移植皮瓣坏死、填充脂肪吸收率高等难题。我们前期建立了从人体脂肪组织中提取无细胞脂肪组织提取液(Cell-free fat extract，CEFFE)技术，该技术可以获得富含各类生长因子而不含活细胞的液体，具有调节炎症、促血管新生、促细胞增殖、抗细胞凋亡、抑制活性氧产生等多种生物学功能。动物实验证实，CEFFE在皮瓣移植、皮肤扩张、脂肪移植、创面愈合、皮肤光老化等疾病中均有治疗效果。本文就CEFFE技术在皮肤及软组织再生修复中的应用及前景进行综述。

创伤、感染、肿瘤等各种原因可以导致大面积的皮肤及软组织缺损，自体组织移植是目前整形外科的主要手段，其中包括皮肤扩张、皮瓣移植、脂肪组织填充等常用技术。而这些技术在应用过程中仍然存在组织扩张速度缓慢、扩张皮肤回缩、移植皮瓣坏死、填充脂肪吸收率高等难题，其中扩张及移植组织的血供重建是影响其治疗效果的关键因素。传统的药物辅助新生血管形成效果并不明显，近年来间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)治疗在组织再生修复中的作用得到了广泛验证，特别是在皮肤及软组织再生修复中取得了可靠的疗效[1-3]。脂肪组织中分离获得的基质细胞(Stromal vascular fraction，SVF)可以提高皮肤扩张效率[4]，提高颗粒脂肪移植的存活率[5-6]，体外培养扩增的脂肪间充质干细胞(Adipose derived stem cell，ADSC)可以促进难愈性创面的愈合[7-8]，但细胞治疗仍面临安全性、稳定性、致瘤性等难题。研究表明，干细胞主要以旁分泌生长因子的机制发挥作用，包括分泌促血管新生、免疫调节、抗细胞凋亡等因子[9-11]。如果能够获得MSC分泌的活性因子群，就有望建立无细胞介导的生物治疗新技术。我们前期建立了从人体脂肪组织中提取无细胞脂肪组织提取液(Cell-free fat extract，CEFFE)的技术[12]，该技术可以获得富含各类生长因子而不含活细胞的液体，具有调节炎症、促血管新生、促细胞增殖、抗细胞凋亡、抑制活性氧产生等多种生物学功能，有望成为全新的无细胞介导的组织再生修复新技术。

1 CEFFE的由来与特征

2013年，Tonnard等提出了纳米脂肪(Nanofat)的概念，通过对小孔径抽脂管抽吸所得的微小颗粒脂肪进行机械性乳化处理，过滤后获得乳糜状液体即为纳米脂肪。将自体纳米脂肪注射至下睑区或浅表皱纹的真皮内，术后4～6个月可见黑眼圈及浅表皱纹的明显改善[13]。此后，纳米脂肪逐步在修复皮肤缺损、改善瘢痕等方面得到应用[14-17]。动物实验发现，纳米脂肪能促进真皮增厚和新生血管形成，抵抗紫外线引起的皮肤光老化[18]；纳米脂肪还可通过促进血管新生显著提高颗粒脂肪移植的存活率[19]。以往研究认为，纳米脂肪中存在具有活性的脂肪间充质干细胞，是其发挥治疗功能的主要成分。为了探究纳米脂肪的活性成分，我们对纳米脂肪开展进一步分析和探索，提取了不含活细胞和油滴成分的液体层，所获得的液体称为“无细胞脂肪组织提取液(CEFFE)”[12,20]，含有大量与组织再生修复相关的活性因子。蛋白芯片分析显示，CEFFE含1 700多种蛋白；免疫酶联吸附试验检测证实，其中富含胰岛素样生长因子(IGF-1)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质源神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子β(TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生因子(PDGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等多种与组织再生修复相关的活性因子[20-21]，其因子组合与MSC分泌的因子组合相似，由此推测CEFFE可能与MSC一样具有调节炎症、促血管新生、促神经再生、促细胞增殖、抑制活性氧产生、抗细胞凋亡等生物学功能，有望用于多种疾病的治疗。

2 CEFFE技术在整形外科领域的适应症

2.1 皮瓣存活

体外研究显示，CEFFE可以促进脐静脉内皮细胞增殖、迁移、成管；在裸鼠下肢缺血模型中，局部肌肉内注射CEFFE可以挽救缺血下肢的坏死[20]；在大鼠游离皮瓣存活动物模型中，局部皮下注射CEFFE可以提高皮瓣的存活率[21]。深入分析证实，CEFFE通过富含的生长因子促进新生血管形成，改善组织缺血，促进组织存活与再生[20-21]。

2.2 颗粒脂肪移植存活

颗粒脂肪移植后的高吸收率是临床一直希望解决的难题，移植脂肪的存活与组织的再血管化密切相关。在颗粒脂肪移植裸鼠模型中，CEFFE技术可以显著降低脂肪的吸收率，除了促血管新生的作用机理之外，CEFFE还可以通过抗细胞凋亡、促进干细胞增殖等机制发挥作用[22]。

2.3 皮肤光老化

体外试验中，CEFFE可以促进真皮成纤维细胞的增殖与胶原的合成；裸鼠皮下注射可使真皮内微血管数量增加、真皮层厚度增加[23-24]。在紫外线引起的光老化实验中，CEFFE可以通过调节抗氧化酶的表达，抑制紫外线引起的细胞内过氧化物积聚，通过抗氧化、抗细胞凋亡、促细胞增殖与胶原合成、促血管新生等作用，提高真皮组织厚度，抵抗紫外线辐射导致的皮肤老化[25]。

2.4 皮肤扩张

皮肤扩张技术是整形外科常用的组织再生技术，存在扩张时间长、扩张组织回缩等难题。在大鼠皮肤扩张模型中，扩张区域局部注射CEFFE可以促进血管新生，促进真皮组织再生，减少扩张过程中的皮肤破溃，降低扩张后皮肤的回缩[26]。

2.5 难愈性创面

在糖尿病小鼠皮肤创面修复模型中，创面局部注射CEFFE可以缩短创面愈合时间，提高创面愈合率，在负载凝胶的创面涂抹给药方式中也获得了同样的疗效，证实CEFFE通过促细胞增殖、促血管新生、调节局部炎症等机制发挥作用，促进难愈性创面的愈合[27-28]。研究发现，向脂肪组织中加入PBS后进行乳化、离心，所得的下层提取液富含多种生长因子，能够有效促进小鼠创面愈合，同样揭示了脂肪组织来源活性因子在创面修复中的治疗作用[29]。

3 应用于其他疾病

基于CEFFE所含活性因子与间充质干细胞分泌的因子相似，推测其适应症与间充质干细胞的治疗适应症可能高度契合。我们针对在间充质干细胞治疗中已取得初步疗效的疾病类型，拓展了CEFFE的应用方向，证实了CEFFE在呼吸系统疾病(肺纤维化、呼吸窘迫综合征)、消化系统疾病(脂肪肝)、神经系统疾病(外周神经损伤、脑梗死、脊髓损伤)、生殖系统疾病(卵巢早衰、子宫阴道内膜萎缩)等动物模型中均有显著的治疗效果(数据尚未发表)，提示其有望替代间充质干细胞治疗部分疾病。

4 CEFFE技术的优势

制备CEFFE的脂肪组织可通过抽脂获得，抽脂手术对机体的创伤小，另外脂肪组织的抽取对机体的不良影响少，大部分脂肪还可以从塑形减重的抽脂手术获得，来源广泛。与脂肪间充质干细胞治疗相比，其存在明显的优势。

4.1 制备过程简单

CEFFE制备不涉及外源性化合物，整个过程仅涉及破碎、离心、过滤等一系列物理操作，所含成分均来源于脂肪组织，确保其成分的安全性，整个制备可通过一体化的设备来实现，成本较低[20]。而干细胞制备过程中涉及酶消化、细胞培养、扩增等复杂的过程，降低了安全性，同时制备需要专业的技术人员来实现，成本昂贵[30]。

4.2 质量可控

CEFFE提取后可以通过检测其中生长因子的含量来实现质量控制，保存和运输过程无须添加额外的保护剂，和普通的重组生长因子一样，在低温下就可维持生长因子的活性。干细胞的稳定性尚难控制，目前尚无标准的分离与体外扩增培养方法[31]。研究表明，不同的人员、试剂、保存方式、运输条件和时间等均可影响干细胞的特性，同时无法实现细胞状态的实时监测，很难进行质量控制[32-33]。

4.3 疗效稳定

干细胞的疗效依赖于移植后细胞的存活及活性，而其存活依赖于细胞是否能承受移植区域的恶劣环境，包括缺血、缺氧、炎症等，因此治疗效果可能难以预测[34-36]。而CEFFE直接通过所含的生长因子等活性成分发挥作用，其作用效果是稳定和可预测的。

4.4 给药途径多样

对干细胞静脉输注后体内分布的研究表明，干细胞在静脉给药的过程中大部分会分布于肺组织，真正能够达到创伤部位的细胞量较少，因此往往需要采用局部动脉给药的方式以达到治疗效果[37]。CEFFE可以通过静脉给药的方式作用于全身组织，也可以通过局部给药的方式直接作用于损伤部位，给药途径多样，短期内可反复给药。

4.5 副作用少

干细胞治疗存在细胞栓塞的风险[38]，而CEFFE制备经过滤过处理，不含细胞等大颗粒成分，静脉注射无栓塞风险，局部注射也无红肿、过敏等不良反应。

4.6 同种异体使用

目前，同种异体干细胞移植后的宿主免疫排斥反应仍难以避免[30]，而CEFFE中不含活细胞，理论上不引起免疫排斥，可以实现同种异体的治疗。从不同年龄段和不同部位抽取的脂肪组织中分离获得的CEFFE，主要活性因子的含量无显著差异，提示未来可通过捐献的方式获得脂肪来源，制备通用型的CEFFE生物制剂，实现规模化的应用。

5 CEFFE技术已开展的临床研究

基于CEFFE在皮肤组织再生和抗皮肤光老化方面的作用，上海交通大学医学院附属第九人民医院通过伦理委员会审核，开展了自体来源CEFFE治疗眶周细纹、黑眼圈、萎缩性瘢痕的临床研究。局部皮下多次注射CEFFE可以减少眶周细纹，减退色素沉着，改善瘢痕组织质地，观察期内症状进行性改善，疗效持续稳定。局部注射自体CEFFE除了与注射相关的疼痛和短期淤青外，无感染、红肿、瘙痒、蜕皮、过敏等不良反应。

6 总结

CEFFE原料来源广泛，制备过程相对简单，稳定性好，质量可控，安全性高，副作用少，治疗效果可预测，可以同种异体应用，通过通用型CEFFE制剂的开发，有望实现规模化的临床应用。CEFFE治疗适应证广泛，覆盖全身各大系统的多种难治性疾病，与现有间充质干细胞治疗的疾病类型高度重合，有望克服干细胞治疗存在的诸多瓶颈问题，替代现有间充质干细胞治疗，成为全新的无细胞介导的生物治疗技术。