沈加裙 方 静 马春梅 林丽圆 胡继军

抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染疫苗使用已有30多年的历程，而慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB)仍然是全球常见的疾病[1]。CHB可逐步发展为肝硬化、肝失代偿及肝癌，导致每年死亡人数约100万[2]。目前，抗病毒治疗对大部分CHB患者是有效的，主要包括2类药物：核苷类药物，例如恩替卡韦，可抑制病毒聚合酶及干扰病毒复制；干扰素，包括聚乙二醇类化合物，具有抗病毒和免疫调节作用[3]。对于HBeAg阳性CHB患者，长效型干扰素依然是重要的一线治疗药物，因为在有限的治疗过程后，大约25% 的患者可以获得长期的非治疗持续反应[4,5]。近期国际临床指南提出，HBeAg阳性患者HBeAg血清学转换被认为是持久治疗反应和临床结果改善的标志[6,7]。

HBV RNA是一种游离型病毒，与病毒学反应和预后密切相关[8,9]。CHB患者血清HBV RNA在接受治疗期间的变化仍不清楚，HBV RNA是否能预测HBeAg血清学转换也存在争议。近期有报道指出，接受聚乙二醇干扰素α-2a治疗CHB患者的血清HBV RNA水平可预测HBeAg血清学转换，但其对病毒学反应的预测价值研究甚少，而且研究对象中较多曾经接受过其它相关治疗，可能会影响血清学相关指标结果[10]。基于此，本研究设置更严格的纳入标准，以首次接受聚乙二醇干扰素α-2a治疗的CHB患者为研究对象，观察治疗前和治疗6个月后HBV RNA水平变化，分析HBV RNA与血清其它相关指标的关系及预测HBeAg血清学转换和病毒学应答的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象及分组

纳入2020-04—2020-12本院感染科确诊、并开始接受聚乙二醇干扰素α-2a治疗的CHB患者。纳入标准：(1)首次接受聚乙二醇干扰素α-2a治疗；(2)只接受聚乙二醇干扰素α-2a单一治疗，并未终止；(3)签署知情同意书。排除标准：(1)严重肝脏相关并发症(包括失代偿性肝硬化、肝细胞癌和肝移植)；(2)同时感染人类免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)；(3)药物联合治疗；(4)治疗前后未获得血清标本；(5)依从性差。研究最终纳入38例CHB患者参加此项统计分析，其中15例患者获得病毒学应答(VR)，23例获得部分病毒学应答(PVR)。CHB患者经过长达6个月聚乙二醇干扰素α-2a治疗后，HBV DNA水平无法检测者为病毒学应答组，HBV DNA阳性(水平降低>2 log10 copies/ml)纳入部分病毒学应答组。38例患者中男31例、女7例，平均年龄为37.53岁；HBeAg阳性患者有32(84.2%)例，血清HBV RNA水平为4.12 log10 copies/ml(见表1)。在治疗前，32例患者为HBeAg阳性，其中14例在治疗期间获得血清学转换。每位患者均签署知情同意书，该研究也获得医院伦理委员会批准。

表1 CHB患者一般临床表征

分组：(1) 依据治疗后结果分为病毒学应答组(VR组，n=15，经6个月治疗后，HBV DNA水平降低>2log10 IU/ml)和部分病毒学应答组(PVR组，n=23，经6个月治疗后，HBV DNA水平无法检测)；(2)根据HBeAg分为HBeAg+血清学转换组(A组，n=14)、HBeAg+血清学非转换组(B组，n=18)和HBeAg阴性组(C组，n=6)。

1.2 治疗方法

聚乙二醇干扰素α-2a注射液(上海罗氏制药公司，国药准字J20190068，规格：180μg/支)皮下注射治疗，180μg/次，1次/周，持续治疗6个月。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 血样采集及处理：分别采集CHB患者治疗前后空腹静脉血5ml，经3 000r/min离心10min，取血清。

1.3.2 主要观察指标：(1)谷丙转氨酶(ALT)采用全自动生化分析仪(AU5800型，贝克曼库尔特)及其配套试剂进行检测。(2)采用Architect i2000化学发光免疫分析仪(美国雅培公司)及其配套试剂对HBsAg和HBeAg进行定量分析。(3)荧光定量COBAS TAQ-MAN仪(罗氏)及试剂(中山大学达安基因公司)检测HBV DNA水平，最低检测限为100IU/ml；与GenBank(NCBI)数据库中preS/S基因序列比对，进而鉴定HBV基因型。(4)qRT-PCR法检测血清HBV RNA水平，采用QIAamp Viral Mini试剂盒(Qiagen，Germany)提取血清中HBV RNA，将其逆转录为cDNA，特异性引物序列为：5，-ACC ACG CTA TCG CTA CTC-3，。ABI Prism 7500测序检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, 美国)对HBV RNA进行定量分析，采用Taqman探针法。引物序列为：F: 5，-ACC ACG CTA TCG CTA CTC AC-3，，R:5，-CAA CTT TTT CAC CTC TGC CTA-3，；探针序列为：(TAMARA)CAT GTC CTA CTG TTC AAG CCT CCA AG(BHQ2)。qRT-PCR反应体系共25μl，包含2.5μl的Buffer(10×)、2μl的dNTPs(2.5mmol/L)、每种引物各1μl、0.5μl的探针、0.25μl的Taq DNA聚合酶和17.75μl的ddH2O。反应条件为95℃变性10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 VR 组与 PVR 组各有关指标比较

治疗前，PVR组患者HBV DNA和HBsAg水平均高于VR组，HBeAg+百分率高于VR组，差异有统计学意义(P<0.05)，两组患者血清ALT和HBV RNA水平无明显差异(P>0.05)。治疗后，与VR组患者比较，PVR组患者血清HBV RNA和HBV DNA均升高，HBeAg+百分率和ALT水平高于VR组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。两组HBsAg差异无统计学意义(P<0.05)。相比于治疗前，治疗后VR组患者血清ALT、HBV DNA和HBV RNA水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)，PVR组患者血清HBV RNA水平显著升高，ALT和HBV DNA水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 VR组与PVR组CHB患者治疗前后各指标比较

2.2 A组、B组、C组治疗前后各有关指标比较

治疗前，A组与B组患者各指标差异均无统计学意义(P>0.05)；与A组比较，治疗前C组患者血清HBV DNA较低(P<0.05)。治疗6个月后，A组、B组和C组ALT和HBV DNA均较治疗前降低(P<0.05)，A组和B组HBV RNA较治疗前降低(P<0.05)；治疗后B组患者血清HBV RNA水平显著高于A组(P<0.05)。见表3。

表3 不同HBeAg血清学转换CHB患者治疗前后各指标水平比较

2.3 多因素回归分析CHB患者HBeAg血清学转换和病毒学应答的影响因素

实验进一步采用多因素回归分析影响CHB患者HBeAg血清学转换和病毒学应答的临床指标，将具有差异性的HBsAg、HBV DNA和HBV RNA指标进行分析，结果发现HBV RNA水平与HBeAg血清学转换和病毒学应答均显著相关(P<0.01)。

2.4 ROC曲线分析HBV RNA对HBeAg血清学转换和病毒学应答的预测价值

治疗前HBV RNA水平对HBeAg血清学转换有较好的预测价值(AUC=0.852)，此时Cut off值为4.08 log10 copies/ml、敏感度为0.83、特异度为0.79。治疗后HBV RNA水平对病毒学应答具有较好的预测价值，Cut off值为3.05 log10 copies/ml，AUC=0.803、敏感度和特异度分别为0.76和0.71。见图1和图2。

图1 治疗前HBV RNA对CHB患者HBeAg血清学转换的ROC曲线分析

图2 治疗后HBV RNA对CHB患者病毒学应答的ROC曲线分析

3 讨 论

60%的CHB患者接受抗病毒药物治疗1年后，血清HBV DNA水平会降低至检测下限；然而，一些患者还会出现血清学反应，如HBeAg、HBsAg抗体消失[11]。因此，如果HBV DNA维持在不可检测水平，很难预测患者是否获得血清学反应。为了解决这样一个难题，本研究探讨HBV RNA水平与CHB患者的病毒学应答和HBeAg血清学转换的关系，以及HBV RNA是否是预测HBeAg血清学转换的独立因素及其诊断价值。

表4 多因素回归分析HBeAg血清学转换和病毒学应答的影响指标

通过比较VR组和PVR组患者血清HBV RNA水平的动态变化，发现VR组患者血清HBV RNA水平显著降低。然而，PVR组患者血清HBV RNA水平则显著升高；由此说明，有效抑制病毒复制不仅是降低HBV DNA水平，而且还得降低HBV RNA水平[12]。另外，A组相比于B组患者血清HBV RNA显著降低，说明HBeAg血清学转换有利于病毒载量降低。早期已有研究报道，血清HBVRNA是出现在病毒样颗粒中的前基因组RNA(pgRNA)，而阻断HBV聚合酶可以导致pgRNA聚集，接受抗病毒治疗后HBV RNA水平会降低[13,14]。CHB患者在接受抗病毒治疗时，获得HBV RNA阳性血清学转换的患者血清HBV RNA水平明显降低[15]，该研究结果与本文发现一致。上述结果提示，HBV RNA可以预测抗病毒治疗的效果及HBeAg血清学转换。

多变量因素回归分析结果表明，血清HBV RNA是CHB患者获得HBeAg血清学转换和VR的影响因素。尽管可通过检测HBV DNA水平来提示患者是否获得病毒学应答，但是在获得PVR的患者血清中HBV RNA水平升高。由于血清HBV DNA和RNA都只来源于cccDNA，于是阻断逆转录活性的可部分作用引起HBV RNA水平增加。ROC曲线分析表明，治疗后获得HBeAg血清学转换和病毒学应答的患者血清HBV RNA水平会降低。

总之，CHB患者血清HBV RNA水平可以较好的预测HBeAg血清学转换和病毒学应答；而且CHB患者血清HBV RNA水平低于4.08 log10 copies/ml时可更好的获得HBeAg血清学转换。因此，聚乙二醇干扰素α-2a 用于治疗慢性乙型肝炎，凭借其双重作用机制实现持久免疫控制，可有效提高乙肝病毒学指标转阴率、改善肝功能，值得临床推广应用，而且其治疗效果还可用HBV RNA水平进行预测。

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