况嘉铀，屈廷啟，韦胜，王伟平*

(1.湖北工业大学 生物工程与食品学院，武汉 430068；2.湖北工业大学 工程技术学院，武汉 430068)

红曲色素是红曲霉发酵过程中产生的天然、可食用的色素，具有着色力强、稳定性好等优点[1]，但是红曲霉发酵过程中还会产生真菌毒素——桔霉素[2]，严重影响食品安全，因此如何降低红曲产品中桔霉素的含量已经成为红曲色素研究领域的重点问题。目前，为了控制红曲霉发酵过程中桔霉素的合成量，同时保证红曲色素的产率，国内外学者分别从菌种的选育、发酵工艺优化[3-4]、基因分子水平调控[5]等方面进行研究，取得了较大进展。周珂等[6]通过液态发酵条件优化使红曲黄色素达到了108.38 U/mL，Kumiar等[7]通过优化培养基将红曲色素的总产量提高了1.5倍；蒋冬花等[8]在基因分子水平上将红曲霉色素相关基因(PigE)取代潮霉素抗性基因(hph)，得到1株高产红曲黄色素产量为9232.86 U/g的基因工程M-piy菌株，比野生菌株提高了9.6倍，而桔霉素的含量显著降低。

温度是影响红曲霉生长代谢的一个重要因素[9-11]。Tao等发现当发酵温度从30 ℃增加到35 ℃时，有利于强荧光红曲黄色素的生成。管宏伟等[12]发现当发酵温度从26 ℃增加到30 ℃时黄色素的生成量提高了1倍，不同温度下红曲黄色素的生成存在明显差异。本文研究了不同温度对红曲霉合成红曲黄色素及桔霉素的影响，分析比较了发酵液的终止pH值，研究结果为红曲色素发酵过程中的温度控制提供了理论依据，对于食品安全型红曲色素的生产过程控制具有一定指导意义。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

红曲霉(Monascus)GN：由湖北工业大学生物工程实验室保藏。

大米粉、黄豆粉：均为食用级；葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、琼脂、KH2PO4、MgSO4·7H2O等：均为国药分析纯；乙腈：色谱纯。

1.2 仪器与设备

雷磁PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；GI65DWS立式自动压力蒸汽灭菌器 致微(厦门)仪器有限公司；ZGJH-1214垂直流超净工作台、ZHWY-2112B双层特大容量全温度恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；DNP-9052型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司； Thermo Fisher ST16R高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技(中国)有限公司；722S可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；高效液相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.3 培养基

斜面培养基：葡萄糖6%、蛋白胨2%、可溶性淀粉3%、琼脂3%，115 ℃灭菌30 min。

种子培养基：大米粉2%、黄豆粉1%、葡萄糖1%、蛋白胨1%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%，接种摇瓶培养，装液量为200 mL/500 mL三角瓶，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：大米粉5%、黄豆粉1%、(NH4)2SO40.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、KCl 0.05%、FeSO4·7H2O 0.0005%、MnSO4·H2O 0.003%、ZnSO4·7H2O 0.0005%，100 mL/250 mL三角瓶，121 ℃灭菌20 min。

1.4 方法

1.4.1 培养方法

斜面培养：挑取1环红曲霉GN于斜面培养基上，30 ℃培养7 d。

液体种子培养：用接种环在长好的斜面培养基中刮取2环接种到种子培养基中，30 ℃，200 r/min培养2 d。

液体发酵培养：将种子液按体积分数10%接种至发酵培养基，分别在不同温度(20，22.5，25，27.5，30 ℃)下，以200 r/min摇瓶培养7 d。

1.4.2 pH值的测定

采用pH计测定。

1.4.3 红曲黄色素色价的测定

移取1 mL发酵液加入9 mL 70%的乙醇溶液，置于60 ℃恒温摇床中，200 r/min萃取1 h，4000 r/min离心15 min，取上清液稀释至20倍，在410 nm处测定黄色素的吸光度。计算结果为OD值乘以稀释倍数[13]。

红曲黄色素的色价E(U/mL)=吸光度×200。

1.4.4 桔霉素的测定

HPLC色谱法：取发酵液5 mL，加入10 mL的无水乙醇，在60 ℃恒温摇床中，200 r/min萃取1 h，在8000 r/min的条件下离心10 min，吸取上清液，经0.45 μm有机滤膜过滤，即得待测液。

HPLC色谱条件[14]：流动相：V(超纯水，用磷酸调pH至 2.5)∶V(乙腈)为50∶50；荧光检测：λex=331 nm，λem=500 nm；色谱柱：Eclipse XDB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；体积流量：1 mL/min；柱温28 ℃；上样量：标准品及样品均为20 μL。

2 结果与分析

2.1 温度对发酵液终止pH值的影响

图1 不同发酵温度对红曲霉终止pH值的影响Fig.1 Effect of different fermentation temperatures on the pH values of Monascus at the end of fermentation

在不同发酵温度下，红曲霉发酵液的终止pH值存在明显差异。由图1可知，随着发酵温度的降低，发酵终止pH值逐渐降低。在20 ℃时最低，pH值为2.89；30 ℃时最高，pH值为4.38。温度对发酵过程中的影响主要表现为影响微生物生长过程中的酶反应速率和生物合成途径。微生物在不同温度的发酵过程中代谢产生的有机酸存在明显区别[15]，如酵母菌在20 ℃时代谢产乙酸的能力强于25 ℃和30 ℃[16]；乳酸菌在不同温度下随着时间的变化，总酸呈现出不同的差异性[17]。红曲霉在不同温度下发酵终止pH值存在差异，这可能是因为温度的改变影响了红曲霉生长过程中淀粉酶、糖化酶等多种酶的酶活性和有机酸等酸性物质的合成，导致随着发酵温度的降低，终止pH值逐渐降低。

2.2 温度对红曲色素合成的影响

不同发酵温度下红曲黄色素色价的测定结果见图2。

图2 不同发酵温度对红曲黄色素合成的影响 Fig.2 Effect of different fermentation temperatures on the synthesis of Monascus yellow pigment

由图2可知，黄色素随着温度的升高先是呈现上升的趋势，在22.5 ℃时达到最大值(黄色素色价为117.8 U/mL)，然后逐渐下降，在30 ℃时色素产量最低(黄色素色价为45.6 U/mL)。红曲霉发酵合成的红曲色素与H+的浓度密切相关[18]，Li等[19]发现pH值为3时的酸性发酵条件下，可以积累大量高纯度(79.1%)的红曲橙色素，所得橙色素的色价为76 U/mL。杨建等[20]研究发现当红曲霉固态发酵过程中补水(pH 4)时，总色价和橙色价可以达到最大值，分别为6600 U/g和2640 U/g；周波等[21]发现硝酸铵为氮源时会促进胞外黄色素的分泌，但对黄色素总生成量并没有促进合成的效果，其黄色素色价最高为44.4 U/mL。低温条件改变了发酵液中有机酸的组成，导致红曲色素的合成与分泌发生了改变。过低的pH值会影响红曲色素的生物合成[22]。20 ℃时终止pH值较低(pH<3)，抑制了红曲黄色素的合成代谢，而22.5，25，27.5 ℃时表现为较高红曲色素的生物合成。

2.3 温度对桔霉素合成的影响

不同温度对桔霉素合成的影响见图3。

由图3可知，桔霉素生成量随着温度的升高而呈现先增加后逐渐降低的趋势，与红曲黄色素的合成趋势相近。20 ℃时的桔霉素合成量为1.89 mg/L，随着温度的升高，当发酵温度为22.5 ℃时达到最大值，桔霉素的生成量为4.38 mg/L，而后又随着温度的升高而逐渐降低，当发酵温度为30 ℃时，桔霉素的合成量为1.71 mg/L，此时的桔霉素合成量最少。在20，25，27.5，30 ℃条件下，桔霉素的生物合成量较为接近，处于1.7～1.9 mg/L范围内。在2.1中得到20 ℃时终止pH值低于3，此时的桔霉素生物合成受到了抑制，随着温度的升高，发酵终止pH值大于3，抑制桔霉素合成的能力减弱。结果表明桔霉素的合成可能与发酵过程中的pH值具有一定的相关性，穆洪霞[23]发现当pH为2左右时，红曲霉发酵液中几乎无法检测到桔霉素的生物合成，Kang B等发现发酵过程中的pH值变化可以调节桔霉素的生物合成，在极低的初始pH条件下不会合成桔霉素。Xiong Xu等[24]以玉米粉∶小麦淀粉(30∶30，g/L)为底物，玉米、小麦等农作物具有良好的缓冲性，在红曲霉发酵过程中使pH保持在2.6～3，桔霉素在TLC分析中未检测到。另一方面，Chen等[25]研究红曲霉本身具有代谢桔霉素的能力，当温度相对较高时红曲霉能分解桔霉素进行再次利用，最终导致22.5～30 ℃时桔霉素依次降低。

图3 不同发酵温度对桔霉素含量的影响 Fig.3 Effect of different fermentation temperatures on citrinin content

3 结论

低温条件改变红曲霉GN发酵过程中的pH值，研究低温条件对红曲霉GN生物合成红曲黄色素及桔霉素的影响。低温条件下改变红曲霉发酵过程的pH值，使终止pH处于2.8～4.4，在此pH值下有利于红曲色素的生物合成，但也有利于桔霉素的生物合成。20 ℃时发酵终止pH值为2.89(pH<3)，表现为抑制红曲黄色素及桔霉素的合成代谢，此时的红曲黄色素和桔霉素表现为急剧降低，22.5 ℃时红曲色素的合成量达到最大值，但桔霉素的合成量也达到了最大值，而在25 ℃时，红曲色素的含量与22.5 ℃时接近，桔霉素含量却与20，27.5，30 ℃时相差不大，相较于其他温度，25 ℃更适合红曲黄色素的发酵生产。