冯秀梅 ，马 兰，罗玉群 ，李海滨，马纹蕊

(1.青海省中医院乳腺科，青海 西宁 810000；2.青海大学医学院,青海 西宁 810008)

现阶段，乳腺癌的治疗多采用以手术为主的综合化疗，辅助治疗如放化疗、内分泌治疗和生物靶向治疗在其中亦扮演着至关重要的角色[1]。同时，随着健康筛查的普及，乳腺癌的发生率和病死率状况得到改善[2]。然而，即使在诊疗水平不断完善的今天，乳腺癌患者的确诊率、术后复发转移率仍然居高不下[3]。寻找合理而有效的乳腺癌治疗策略和药物一直是医学界的重点问题。中医药治疗肿瘤已有悠久历史，且成效颇为显著，具有改善患者生存质量、降低转移复发率、延长患者生存期等优势[4-5]，已成为手术、放化疗、基因疗法外的重要治疗手段。

气机不畅则气郁血瘀。在中医学上，乳腺癌的发生与气血失调、瘀血痰饮密切相关[6]。此外，microRNA表达谱的变化已被证实与肿瘤的发生发展密切相关[7]。同时，既往研究已证实microRNA-100(miR-100)可直接负向调控乳腺癌细胞增殖能力[8]。鉴于此，本研究探究益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞系增殖侵袭能力及miR-100表达水平的影响，以期为乳腺癌筛查提供良好生物学标志物，并为该肿瘤的中医治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 MCF-7乳腺癌细胞系(购自中国科学院上海细胞研究所)以含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基培养，置于36 ℃的饱和湿度恒温孵育箱中培养。取生长良好的细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，进行后续试验。

1.2 试验试剂、仪器及药物 RPMI-1640培养基(Hyclone公司，USA)；DMEM高糖培养基(Hyclone公司，USA)；0.25%胰蛋白酶和胎牛血清(FBS；Gibco公司，USA)；磷酸盐缓冲液(PBS；Hyclone公司，USA)；Tap Man MicroRNA荧光定量PCR检测试剂盒(Applied Biosystems公司，USA)；二甲基亚砜(DMSO；国药集团，中国)；噻唑蓝(MTT；Sigma公司，USA)；培养板及离心管(Corning公司，USA)；高速恒温离心机(Thermo Forma公司，USA)；全自动酶标仪(BioTek公司，USA)；倒置显微镜(Olympus，日本)。益气活血方配方由本院制剂部提供，该药方组成包括黄芪、薏仁、茯苓、白术、红花、当归等；以上药物以煎煮方式浓缩至1.4 g/ml，制备后置于4 ℃冰箱保存。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及细胞处理：取对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞系，采用含10% FBS培养液进行培养。将上述制备药物采用培养液稀释为20、40和80 mg/L，设置高、中和低浓度分别培养细胞，并设置对照组(无药物的相同培养液)。

1.3.2 qRT-PCR检测miR-100的表达水平：取对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞系，依据上述方法分组处理细胞。吸取细胞培养基，以1.0 ml TRizol吹打细胞，室温裂解2～3 min。离心弃上清，计算RNA浓度和波长260 nm和280 nm处吸光度值。按照Tap Man Micro RNA荧光定量PCR检测试剂盒逆转录后，应用qRT-PCR进行定量检测；以U6为内参。以相对定量法进行分析，反应条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共计40个循环。本实验所用引物均由Applied Biosystems公司合成。反应结束后计算CT值，应用2-△△CT法计算miR-100相对表达量。

1.3.3 MTT法检测乳腺癌细胞增殖情况：应用MTT法检测乳腺癌细胞系MCF-7的细胞增殖情况并对比组间差异。依据商法将益气活血方浓缩液用DMSO溶液溶解并稀释，取对数生长期MCF-7细胞置于培养液中培养，调整细胞浓度，接种于96孔板，以20、40和80 mg/L浓度的益气活血配方溶液培养细胞。分别培养24 h、48 h和72 h后，每孔避光加入20 μl 0.5%MTT溶液，孵育4 h后弃去培养液，每孔加入DMSO溶液(150 μl)。于波长490 nm处采用酶联免疫吸附仪检测各孔吸光度值(OD)。以不含药方溶液的完全培养基培养细胞为对照。采用MTT法检测MCF-7细胞增殖抑制率。MCF-7细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3.4 Transwell小室法检测乳腺癌细胞侵袭情况：应用Transwell小室法检测乳腺癌细胞系MCF-7的细胞增殖情况并对比组间差异。同法处理细胞，以20、40、80 mg/L浓度的益气活血配方溶液培养细胞为高、中和低浓度实验组，以不含药物的相同培养液培养细胞为对照组。取Transwell小室加入Matrigel胶，接种细胞前加入50 μl含体积分数1%FBS的培养液，37 ℃下培养30 min，再次应用含1%FBS的培养液重悬细胞，调整细胞浓度至1×105/ml，接种于上室；下室加入600 μl DMEM培养液，继续培养24 h。PBS清洗上室后拭去未侵袭细胞。细胞侵袭抑制率计算公式如下所示：MCF-7细胞侵袭抑制率=(1-实验组细胞侵袭数/对照组细胞侵袭数)×100%。

1.3.5 Western blot法检测增殖侵袭相关蛋白：取对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞系，依据上述方法分组处理细胞后，收集各组细胞经RIPA裂解液裂解细胞，离心取上清。采用BCA法检测蛋白质含量。取蛋白样本经10% SDS-PAGE电泳，湿转法转膜后将PVDF膜应用50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h。随后，将PVDF膜与细胞增殖相关蛋白特异性周期蛋白D1(Cyclin D1)和侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶-9(MMP-9)一抗孵育过夜(4 ℃)；TBST洗涤3次后，常温下与HRP标记二抗孵育1 h。ECL法显影后采用凝胶成像仪扫描胶片并保存和分析结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间样本数据比较采用t检验；多组间样本数据比采用卡方检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞miR-100表达水平的影响 PCR检测对照组miR-100表达水平为(1.00±0.05)；实验组miR-100表达水平升高，其中低、中和高浓度组分别为(1.38±0.05)、(1.54±0.05)和(1.71±0.07)，与对照组相比差异有统计学意义(均P<0.05)。同时，在实验组内，与较低浓度组相比，较高浓度组miR-100表达水平亦呈上升趋势，实验组间差异亦存在统计学差异(均P<0.05)，提示miR-100表达水平在实验组间升高趋势呈剂量依赖性(图1)。

图1 PCR实验检测不同浓度益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞miR-100表达水平的影响

2.2 不同浓度益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响 见表1。根据MTT实验检测，组间比较结果显示：在培养24 h时，各组间细胞增殖抑制率差异无统计学意义(均P>0.05)；而在培养48 h和72 h时，与对照组相比，实验组细胞增殖抑制率明显升高，差异具有统计学意义(均P<0.05)，提示细胞增殖能力下降；同时，与较低浓度组相比，较高浓度组细胞增殖抑制率亦呈上升趋势，实验组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)，提示细胞增殖能力在实验组受抑制，且呈剂量依赖性。

表1 不同浓度益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制率的影响

2.3 不同浓度益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞侵袭的影响 见表2。依据Transwell小室法检测结果，益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞侵袭具有抑制作用，具体表现为与对照组相比，实验组细胞侵袭抑制率明显升高，差异具有统计学意义(均P< 0.05)，提示细胞侵袭能力的下降；同时，与较低浓度组相比，较高浓度组细胞侵袭抑制率亦呈上升趋势，实验组间比较亦存在统计学差异(均P<0.05)，提示细胞侵袭能力在实验组受抑制，且呈剂量依赖性。

表2 不同浓度益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞侵袭抑制率的影响

2.4 不同浓度益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和侵袭相关蛋白MMP-9表达水平的影响 见表3。不同浓度益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和侵袭相关蛋白MMP-9表达水平Western blot蛋白检测结果提示：与对照组相比，实验组Cyclin D1和MMP-9蛋白表达水平明显降低，差异具有统计学意义(均P<0.05)；同时，在实验组内，与较低浓度组相比，较高浓度组Cyclin D1和MMP-9蛋白表达水平亦呈下降趋势，实验组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)，提示Cyclin D1和MMP-9蛋白表达水平在实验组间降低趋势呈剂量依赖性。

表3 不同浓度益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和侵袭相关蛋白MMP-9表达水平的影响

3 讨 论

众所周知，细胞增殖侵袭等是恶性肿瘤发生发展的基本特征，亦是患者病情转移和复发的主要原因[9]。近年来，乳腺癌的发病率逐年上升[10-11]，位居女性肿瘤发病率首位，其病死率不容乐观。现阶段的乳腺癌综合治疗手段众多，如手术、以顺铂为主的化疗、放疗等。然而，上述疗法亦不同程度存在癌细胞转移、药物耐药性、不良反应等。基于此，以中医药为辅的治疗方案一直是医学界的研究热点。其在减轻化疗药物不良反应、增强抑癌效果、提高患者耐受性和生存质量等方面作用显著[12-13]。

在中医学中，“虚瘀致癌”理论已逐渐获得认同[14]。正气不足、气血运行受扰，导致瘀血形成；同时，受外邪侵袭，转移微环境导致肿瘤复发转移风险更高[15]。乳腺癌在中医学中与“乳岩”“乳痈”“乳痛”和“乳痃”等相对应。古书有记载：“内寒之气，经虚血结”“忧怒郁闷，昕夕积累，脾气消阻，肝气横逆，遂成隐核”“乳岩初结核隐疼，肝脾两损气郁凝”[16-17]。乳腺癌的病机与肝、肾、脾、胃等器官均存在关联。肝气不舒、肝脾不和、气滞血瘀、郁结伤脾、瘀毒蕴结，经络受阻，最终导致疾病的发生发展[18]。因此，“益气活血法”不失为一种治疗乳腺癌的良方。

本研究选用益气活血方由黄芪、薏仁、茯苓、白术、红花、当归等组成。重用补气血的黄芪、薏仁、茯苓、白术、当归；活血化瘀的红花和当归；另外，茯苓、白术亦可健脾益气，黄芪、白术可补气健脾固表，最终发挥益气扶正、补气健脾、生津补气、除痰祛湿等功效，进而益气、除湿、和中、补血、健脾[19-20]。本研究取对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞系，设置益气活血方高、中和低浓度实验组，并设置对照组。结果显示，与无药物处理对照组相比，实验组miR-100表达水平升高、细胞增殖抑制率提升、细胞侵袭抑制率升高，且Cyclin D1和MMP-9蛋白表达水平明显降低；同时实验组内与较低浓度组相比，较高浓度组miR-100表达水平升高、细胞增殖抑制率和侵袭抑制率升高，以及且Cyclin D1和MMP-9蛋白表达水平下降趋势呈剂量依赖性。上述结果提示，益气活血方可有助于提高具有抑癌作用的miR-100表达水平，并降低细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和侵袭相关蛋白MMP-9表达水平，进而抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。

综上所述，本研究提示益气活血方可提高miR-100表达水平、降低Cyclin D1和MMP-9表达水平、进而发挥抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭的功能。本研究提示该组方可有效调节肿瘤增殖侵袭过程，进而抑制癌细胞转移，为益气活血方治疗乳腺癌提供了思路。