郭 璐，赵兵刚，冯 婷，刘 沛

(空军军医大学西京医院急诊科，陕西 西安 710032)

压疮又称褥疮、压力性溃疡，其发生主要是在压力、摩擦力以及剪切力等物理力学复合作用下所引起的皮肤及皮下组织的局限性损伤，往往由于其久治不愈，最终合并严重感染导致恶病质、营养不良、终末期患者的死亡。组织坏死是Ⅲ期及以上压疮重要的病理学改变之一，程序性坏死是一种由死亡受体和配基启动、依赖于受体相互作用蛋白活化介导的可调控性细胞坏死，其中受体相互作用蛋白激酶(Receptor-interacting protein，RIP)1/3是程序性坏死关键控制信号分子[1-2]，联同下游的混合系激酶区域样蛋白(Mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL)，共同决定细胞命运-凋亡、坏死或存活。中医学认为，生肌散具有祛风去瘀，解毒生肌之功效，可用于疮疖久溃，肌肉不生，久不收口[3-4]。然而现代医学对生肌散的作用机制研究甚少。本研究通过制作SD大鼠Ⅲ期压疮模型，给予生肌散创面处理，对比各组大鼠压疮组织病理学、RIP1/RIP3/MLKL蛋白表达特征以及脂质过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)以及炎症介质白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量变化，以期为生肌散治疗压疮提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 SPF雄性SD大鼠60只，体重(250±30)g，购自空军军医大学实验动物中心[实验动物使用许可证编号：SCXK(陕) 2019-001]，大鼠饲养于空军军医大学药理学实验室动物室内，通风良好，环境安静，温度恒温在25 ℃，动物实验符合相关伦理要求并给予人道关怀(动物实验伦理编号为：IACUC-200403)；生肌散购自北京同仁堂制药厂，国药准字 Z11020782。大鼠IL-1β、TNF-α 酶联免疫吸附试剂盒(购自杭州联科生物技术股份有限公司，批号分别为70-EK101B2，70-EK1822)；MDA检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(购自江苏碧云天生物技术研究所，批号分别为S13245，P0010S，C0105)；山羊抗兔IgG二抗、兔抗大鼠RIP1、RIP3、MLKL抗体(购自美国Abcam公司，批号分别为ab34712，ab51475，ab47633)。

1.2 仪器与器械 仪器：聚丙烯酰胺凝胶电泳装置、凝胶成像系统购自美国Bio-rad公司；酶标仪购自美国Biotekiotek公司；微量移液器购自德国Eppendorf公司；恒温箱(陕西西安环科实验设备有限公司)。器械：经严格测量磁性磁铁(直径10 mm、厚2 mm、质量2.0 g、1600 Gs)、经高温高压灭菌的铁片(直径10 mm、厚1 mm、质量1.0 g)、无菌器械、电子称。

1.3 动物模型的建立与分组 建立Ⅲ期大鼠压疮模型[6]，具体方法如下：使用异氟烷气体麻醉大鼠，脱毛处理暴露实验鼠左臀部周围皮肤，备皮区域至少5 cm×5 cm大小，碘伏充分消毒手术区。在大鼠左侧臀部做一深至肌肉层切口，钝性分离肌层，埋入圆形铁片(直径10 mm，厚1 mm，质量1.0 g)，连续缝合切口，苏醒后正常喂养。实验开始时，在皮肤外，放置相同大小圆形磁铁(直径10 mm、厚2 mm、质量2.0 g、1600 Gs)，利用磁性对局部皮肤及肌肉产生压力，造成局部组织缺血，每次缺血时间为2 h，间隔30 min，此为1个循环操作，进行30个循环操作(加压缺血2 h，间隔30 min，再进行加压)。建模成功标准：铁片边缘红肿、糜烂，伤口渗液或渗血，受压处皮肤变黑变硬，针刺皮肤未见出血，无痛觉，无筋膜、肌肉、骨骼等暴露。

按随机数字表法将60只大鼠分为实验动物，并随机分为对照组、模型组、治疗组各20只。模型组：制作Ⅲ期大鼠压疮模型，成模后，每日清创处理创面，创面外敷0.9%氯化钠溶液纱布，2次/d，共7 d；对照组：仅同部位埋入磁铁不予磁性加压，其余处理同模型组；治疗组：成模后，创面外敷生肌散2 mg，厚度为1 mm，然后用纱布覆盖，2次/d，共7 d，其余处理同模型组。实验结束后脊椎脱臼法处死大鼠取材，各组大鼠压疮皮肤组织提取总蛋白后置于-70 ℃冰箱保存备用。

1.4 组织病理学观察 实验结束后，冰上迅速切取受压中心部位肌肉组织，10%甲醛溶液固定，梯度酒精脱水，二甲苯溶液浸泡透明，浸蜡包埋，使用切片机切成5 μm厚薄片，置入60 ℃烤箱中烘烤后脱蜡，进行苏木素染色、伊红染色，水洗后脱水，二甲苯溶液浸泡透明，封片，光学显微镜下观察。

1.5 蛋白免疫印迹法比较各组大鼠压疮皮肤组织RIP1、RIP3、MLKL的变化 实验结束后，提取组织蛋白，经用100 g/L 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、室温封闭后，分别加兔抗大鼠RIP1(1∶1000)、RIP3(1∶1000)、MLKL(1∶1000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶2500)孵育2 h，洗膜后，用增强化学发光法显色、显影，凝胶成像分析系统摄像分析，并以β-actin为内参。

1.6 试剂盒法测定各组大鼠压疮皮肤组织MDA含量 按照说明书，将MDA检测工作液加入酶标板各孔，接着加入待测定样本，以70 ℃高温加热，并整体震动待混合液彻底溶解。酶标仪(532 nm波长)进行数据读取，利用工作曲线计算样本蛋白的浓度，MDA含量用nmol/mg蛋白表示。

1.7 酶联免疫吸附法测量IL-1β和TNF-α含量 取各组组织提取蛋白0.1 ml，同时加入阳性和阴性的对照标本，按照说明书配置标准品和检测溶液，并按照操作步骤操作，加入终止液后使用酶标仪测定450 nm波长下的吸光度A。

1.8 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间与组内比较均采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠压疮组织病变比较 60只大鼠在观察期间耐受良好，各组大鼠均未出现死亡。肉眼观察结果：模型组大鼠压疮皮肤可见铁片边缘压红，有明显水肿带，可有表皮的糜烂，局部有渗液或渗血，受压部分皮肤颜色加深、变硬，针刺皮肤未见出血，无疼痛反应，未见筋膜、肌肉、骨骼等暴露。治疗组创面病变较模型组明显好转。对照组大鼠皮肤组织未见明显异常(图1)。

光镜观察结果：模型组大鼠压疮皮肤组织表面鳞状上皮细胞损伤、缺失，真皮层菲薄，有大量淋巴细胞和中心粒细胞浸润，间质水肿明显，病灶深达肌肉层，肌纤维萎缩。治疗组大鼠压疮皮肤组织病变较模型组好转，表皮和真皮层损伤断裂、坏死范围明显减少，仅可见少量中性粒细胞浸润。对照组大鼠皮肤组织未见明显异常(图1)。

图1 各组大鼠压疮皮肤组织病变观察结果(HE染色，×200)

2.2 各组大鼠压疮组织中RIP1、RIP3和MLKL表达比较 见表1。与对照组比较，模型组RIP1、RIP3和MLKL表达均明显升高，差异有统计学意义(均P<0.05)；与模型组比较，治疗组RIP1、RIP3和MLKL表达均明显减少，差异有统计学意义(图2)。

表1 各组大鼠压疮组织中RIP1、RIP3和MLKL表达比较

图2 各组大鼠压疮组织中RIP1、RIP3和MLKL表达比较

2.3 各组大鼠压疮组织MDA含量比较 见表2。与对照组比较，模型组MDA含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，治疗组MDA含量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠压疮组织MDA含量比较(nmol/mg)

2.4 各组大鼠压疮组织中IL-1β和TNF-α含量比较 见表3。与对照组比较，模型组IL-1β和TNF-α含量均明显升高，差异有统计学意义(均P<0.05)；与模型组比较，治疗组IL-1β和TNF-α含量均明显减少，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表3 各组大鼠压疮组织中IL-1β和TNF-α含量比较(pg/mg)

3 讨 论

由于Ⅲ期压疮属于开放创面，常常引起严重感染，导致创面难以愈合，极大影响患者预后。各大医院均成立专门针对压疮防治的多学科协作小组，旨在提高压疮的预防，加速创面愈合，尤其针对Ⅲ期压疮的防治，缩短患者平均住院日，减少医疗费用，是临床中的重要任务[5]。

目前制作动物压疮模型装置主要分为非侵入性装置与侵入性装置两大类[6]。非侵入性装置主要有以下两种：体外无创压力装置，但使用该装置时需要实验动物持续处于麻醉状态，而使用麻醉药物导致实验动物全身肌肉松弛，会导致最终的实验结果的偏移；另外一种是非侵入性磁力加压装置，利用两个互相吸引的圆形磁铁之间夹着受试部位，磁力加压形成皮肤损害，然而这种造模方法并不能制备深部组织损伤的压疮模型，因此不适用于Ⅲ期及以上压疮的基础研究。侵入性方法主要有脊髓手术法与侵入性磁力压迫法，其中脊髓手术操作复杂，造模周期较长，动物长期的营养状态对最终实验结果影响较大，并不适合本研究使用。侵入性磁力加压法是将无菌圆形铁片置入皮下，同时外面放置磁铁，然后反复施加和去除磁铁，引起皮肤组织的损伤。该方法造模稳定，可控制压疮分期。造模以后，实验大鼠在观察期间耐受良好，各组均未出现死亡，与其他研究者所得结果类似[7]。

美国国家压疮指导专家组关于Ⅲ期压疮的定义具体如下：全层皮肤损伤，皮下脂肪组织暴露，但未见骨骼肌腱或肌肉，可能存在坏死组织的潜行[8]。但目前研究认为，程序性坏死是一种由肿瘤坏死因子受体(Pattern recognition receptor，PRR)等死亡受体和配基启动、依赖于受体相互作用蛋白活化介导的可调控性细胞坏死[9-11]。有别于细胞凋亡的发生机制，程序性坏死通常发生于组织细胞能量代谢严重障碍的情况下，此时ATP合成生成严重不足，难以维持凋亡通路关键信号分子Caspase活性，凋亡通路因而被抑制，细胞坏死通路被激活[12-14]。RIP1和RIP3均为程序性坏死通路中的关键启动信号分子，联同下游的MLKL，共同决定生命细胞凋亡、坏死或存活[15]。本实验里我们通过制作Ⅲ期SD大鼠压疮模型，发现模型组大鼠压疮组织RIP1、RIP3、MLKL通路关键信号分子蛋白表达明显升高，提示RIP1/RIP3/MLKL 通路介导的程序性细胞坏死在大鼠压疮形成中可能起重要的作用。

压疮在传统中医学中属“疮疡”范畴，由于人体气血两虚，若长期卧床，下垂部位局部受压，加重局部的气血瘀滞，局部组织缺乏气血的滋养，出现皮肤溃疡，因此祛腐生肌、祛瘀补虚是治疗压疮的重要原则[4]。生肌散具有祛风去瘀，解毒生肌之功效，可用于疮疖久溃，肌肉不生，久不收口，在各种疮疡的治疗上均有明显疗效。研究结果显示，治疗组创面病变较模型组明显好转，且与模型组比较，RIP1、RIP3和MLKL表达均明显减少，差异有统计学意义，显示生肌散可能通过抑制RIP1/RIP3/MLKL 通路介导的程序性细胞坏死，促进大鼠压疮创面的愈合。

RIP1与TNF-α受体结合被直接激活，可根据细胞能量状况，选择激发细胞凋亡通路或激活细胞坏死通路，在组织细胞能量代谢严重障碍的情况下，细胞凋亡通路受到抑制,通过 RIP1/RIP3/MLKL 通道激活程序性坏死[16]。研究者发现，压疮模型大鼠血清TNF-α浓度明显升高。受损伤的肌肉细胞可释放多种炎症介质，主要以IL-1β和TNF-α为主，这些炎症介质可引起细胞间黏附因子-1等黏附分子表达上调，促进中性粒细胞募集、附壁、游走等过程，并释放相应的趋化因子，引起一系列炎症反应，从而加重组织水肿的发生[17-18]。局部IL-1β积聚，可刺激炎症细胞产生大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，其氧化应激效应可对细胞脂质双层生物膜产生损伤[17]。脂质过氧化过程中可产生MDA，检测组织中MDA含量是评估细胞生物膜脂质过氧化损伤的重要手段[19-20]。我们的研究显示模型组大鼠压疮组织中MDA含量、IL-1β和TNF-α含量均明显增高，且与模型组比较，治疗组MDA含量、IL-1β和TNF-α含量均明显减少，差异均有统计学意义。由此我们推断，大鼠压疮发生发展过程中，组织细胞内所产生IL-1β和TNF-α等炎症因子，引起的一系列应激反应导致的生物膜脂质过氧化可能与细胞程序性坏死密切相关，但经生肌散处理大鼠压疮创面后，可减少组织细胞中IL-1β和TNF-α产生，减少脂质过氧化，减少组织损伤，然而具体损伤机制仍有待后续进一步的研究发现。

综上所述，本研究组通过制作SD大鼠Ⅲ期压疮模型，生肌散处理创面，比较各组大鼠压疮皮肤组织病理学改变、RIP1/RIP3/MLKL通路关键信号分子蛋白表达、脂质过氧化产物丙二醛、IL-1β和TNF-α含量的差异，结果发现RIP1/RIP3/MLKL通路在压疮形成中发挥重要作用，生肌散可抑制RIP1/RIP3/MLKL 通路介导的程序性细胞坏死，减少组织中IL-1β和TNF-α产生，减少脂质过氧化，减少组织损伤，促进大鼠压疮创面的愈合。