路少鹏 岳敏 张欣欣 李丹 王文魁 齐永华

摘要：【目的】克隆構建利巴韦林（ RBV）单链抗体（scFv）基因，对其理化特xing 进行分析并对蛋白质结构进行模拟，为后期检测方法的建立及分子改造提供参考依据。【方法】以分泌利巴韦林抗体的杂交瘤细胞株总RNA为模板，通过RT-PCR技术扩增抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），然后以柔性连接短肽（Gly4Ser）3为接头拼接完整的scFv-RB V-利用生物信息学方法对scFv-RBV的理化性质及蛋白结构功能进行预测分析。【结果】构建的scFv基因编码240个氨基酸，相对分子质量为26 162.27 Da，理论等电点（pI）为8 57。在二级结构中，p一折叠（3917%）和无规卷曲（45.41%）占主导地位，a-螺旋（5.42%）和β-转角（10%）相对较少。在三级结构中，VH和VL区域被Linker相互牵拉靠近，形成典型的口袋样形状的空问构象，符合单链抗体的结构特征，理论上可以与RBV抗原特异性结合。【结论】成功构建scFv-RBV基因，并利用生物信息学方法预测分析scFv的二级、三级结构，该结果可为后期进行单链抗体的表达、纯化及定向进化提供理论支撑。

关键词：利巴韦林（ RBV）;单链抗体（scFv）;生物信息学;结构预测

中图分类号：S 859.1

文献标志码：A

文章编号：1008-03 84（ 2021） 08-0909-08

Construction and Structure of Anti-ribavirin Single-chain Antibody Gene

LU Shaopeng 1.2， YUE Min 2. ZHANG Xinxin 2. LI Dan 2. WANG Wenkui l*， QI Yonghua 2*

（ 1. College of Animal Medicine. Shanxi Agriczdtural University， Taigu， Shanxi 030801 . China; 2. Henan Engineering

Laboratoryfor Molecular Diagnosis of Animal Diseases， Xinxiang University， Xinxiang， Henan

453000. China ）

Abstract： 【Objective】 The ribavirin （RBV） single-chain antibody （scFv） gene was constructed. cloned. andphysiochemically analyzed to establish a model for the detection method development and molecular modification.【Method】 Using the total RNA of the hybridoma cell line secreting RBV antibody as a template， both heavy-chain （ VH） andlight-chain variable （VL） regions of the antibody were amplified by RT-PCR. Then the short peptide （Gly4Ser） 3 wasemployed as the splicing joint to construct the complete scFv-RB V. Bioinformatics methods were applied to predict and analyzethe physiochemical properties， protein structure. and functions of the gene. 【Results】The constructed scFv-RBV encoded240 amino acids with a relative molecular mass of 26.162.27 Da and a theoretical isoelectric point of 8.57. The secondarystructure of the protein consisted of 39.17% p-sheets. 45.41% random coils. 5.42% a-helices， and 10% p-turns. In the tertiarystructure， the VH and VL regions were pulled close by Linker， forming a typical pocket-like spatial configuration that conformsto the structural characteristics of a single-chain antibody. Theoretically， it could bind specifically to RBV antigens.【Conclusion】 The successfully constructed scFv-RBV in this study afforded the utilization of bioinformatics methods topredict and analyze the secondary and tertiary structures of scFv gene paving the way for further studies on the expression，purification， and directed evolution of the single-chain antibodies.

Key words： ribavirin （ RBV） ;

single chain antibody fragment （ scFv） ： bioinformatics;

protein structure

0 引言

【研究意义】利巴韦林（ Ribavirin，RBV）是一种广谱抗病毒药物，在畜牧业中被广泛用于治疗禽流感、口蹄疫、流行性腹泻、狂犬症等疾病[1-2]。长期使用或滥用可导致动物机体对病毒抵抗力降低，同时也会残留于动物性食品中，因此，我国禁止在畜禽养殖过程中使用RBV[3-4]。免疫学检测技术作为小分子化合物检测的主要手段之一，其核心试剂是高适应性的检测抗体。单链抗体（ single chain antibodyfragment，scFv）是从单克隆抗体衍生而来的一种基因重组抗体，大小仅有完整抗体的六分之一，但具有与亲本抗体完全相同的抗原结合位点[5]。通过分子生物学方法可以将单克隆抗体的VH和VL基因通过柔性连接肽进行拼接，拼接而成的重组蛋白具有分子质量小、特异性及穿透力强等优点，而且可以在分子水平上对其进行定向改造，以便提高其亲和力和特异性，从而更加便捷高效地为体外快速检测小分子化合物残留检测方法的建立提供所需的核心试剂[6]。生物信息学作为一门综合计算机科学、信息技术的学科之一，在蛋白质结构预测、药物设计等方面发挥了重要作用[7-8]。采用生物信息学技术对单链抗体序列进行结构功能分析，后期通过定向改造有望获得高亲和力和灵敏度的单链抗体。【前人研究进展】目前针对利巴韦林药物残留检测方法主要有高效液相色谱法（ HPLC）、毛细管电泳法、分光光度法及比色法等，这些方法可有效检测血清[9]、血浆[10]、红细胞[11]、白龙散等中药散剂[12]中的利巴韦林残留。【本研究切入点】目前关于利用利巴韦林单链抗体检测药物殘留的相关报道较少，针对利巴韦林单链抗体结构的解析及功能研究的报道更是少之又少。【拟解决的关键问题】本研究在获得分泌利巴韦林抗体的杂交瘤细胞株基础上，利用PCR技术扩增出抗体的VH基因和VL基因，然后拼接成scFv-RBV，进行重组质粒构建。后续利用生物信息学方法，预测分析scFv-RBV的理化性质及二级结构，并利用同源建模模拟其三级结构。该研究结果可为后期进行利巴韦林单链抗体的亲和力成熟、抗体蛋白表达及纯化提供一定的理论参考。

1材料与方法

1.1试验材料

抗scFv-RBV单克隆抗体杂交瘤细胞株由新乡学院动物疫病分子诊断河南省工程实验室提供;核酸蛋白分析仪购自美国Beckman-Coulter公司;梯度PCR反应仪和高速低温离心机购白美国Thermo Fisher公司;胶回收试剂盒购自美国OMEGA公司;总RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、HS DNA Polymerase、T4 DNA连接酶及大肠杆菌DH5a感受态细胞均购白大连Takara公司;限制性内切酶ⅣotI和SfiI购白New England Biolabs公司;其他相关试剂均为国产分析纯。

1.2引物设计

按照文献13]设计扩增VH及VL基因的引物，并引入合适的酶切位点SfiI和Not I，Linker选择较常用的（ Gly4Ser）3形式[14];具体引物序列设计如表1所示（引物序列由上海生工生物工程有限公司合成）。

1.3杂交瘤细胞的复苏

为防止细胞在活化复苏时被污染，迅速从液氮罐中取出本实验室保存的可分泌利巴韦林抗体的杂交瘤细胞株，并迅速置于37℃恒温水浴锅中缓慢晃动使其迅速解冻。将解冻后的杂交瘤细胞用10 mLDMEM完全培养基进行稀释，1000 r·mm-1离心5min，弃去上清液，保留沉淀。然后重新加入10 mL DMEM完全培养基重悬细胞沉淀，置于37℃恒温培养箱中培养细胞（5% C02），并隔天对细胞进行传代以保证细胞活力。当细胞数量生长到8×10 6个·瓶-1，选取生长状态良好的细胞提取总RNA。

1.4总RNA的提取及cDNA的合成

为避免外界环境污染而降解RNA，因此，在超净工作台中按照RNA提取试剂盒说明书提取杂交瘤细胞总RNA，然后将其反转录为cDNA（表2）。

1.5 VH和VL基因的扩增

以cDNA为模板，表1的VH和VL的上下游引物，利用PCR技术分别扩增抗体的VH和VL基因（表3）。扩增结束后，使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，然后回收纯化符合目的大小片段的VH和VL基因，纯化后的产物于20℃保存备用。

1.6 scFv-RBV基因的构建

分别以VH和VL基因片段为模板，通过重叠延伸PCR技术扩增VH-1inker和VL-1inker（表4）;扩增结束后，以上述反应产物混合液为模板，表1中的VH-1inker-For和VL-1inker-Back为引物，扩增scFv-RBV基因（表5），然后使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

1.7 重组质粒pCANTAB-5E-scFv的构建与鉴定

利用SfiI和Ⅳot I内切酶将scFv-RBV基因和pCANTAB-5E质粒进行双酶切，然后使用T4 DNA连接酶将酶切后的scFv与pCANTAB-5E质粒进行连接（表6），从而构建重组质粒pCANTAB-5E-scFv。采用电转化法将重组质粒转入DH5a感受态细胞，然后均匀涂布到含氨苄青霉素（ AMP）抗性的LB固体培养基，置于37℃恒温箱培养14-- 16 h。次日挑取3个单菌落进行菌液PCR鉴定，然后将阳性菌进行基因测序。

1.8 scFv-RBV蛋白质结构预测

利用DANMAN软件将测序得到的scFv-RBV核苷酸序列翻译成氨基酸序列，然后使用NCBI分析氨基酸序列的同源性和IgG结构域。采用ExPASyProtParam（ https：//web.expasy.org/protparam/）计算其蛋白分子量、等电点、氨基酸组成等参数[15]，并以SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_au-tomat.pl？page-npsasopma.html）预测分析scFv-RBV的二级结构。在SWISS-MODEL（ http：//swissmodel.expasy.org/）中输入scFv-RBV的氨基酸序列，推测scFv-RBV蛋白的三级结构并进行同源建模。

2 结果与分析

2.1 scFv可变区基因的扩增结果

按照RNA提取试剂盒说明书提取杂交瘤细胞总RNA，结果如图1所示。RNA的条带从上到下分别为28、18和5S，电泳条带无拖尾现象，表明RNA较完整。以反转录后的cDNA为模板，分别扩增抗体的VH和VL基因，图2结果表明，扩增的VH和VL片段大小均在350 bp左右，且扩增得到的条带单一，与预期结果相符。

2.2 重组质粒pCANTAB-5E-scFv的构建及序列鉴定结果

将VH和VL基因等摩尔浓度混匀，采用重叠延伸PCR构建scFv-RBV基因（VH-Linker-VL）。图3结果表明，扩增的条带在750 bp左右有明显的目的条带。构建的重组质粒pCANTAB-5E-scFv电击转化进DH5a感受态细胞后，菌液PCR鉴定结果表明（图4），在750 bp左右有明显的目的条带，初步表明重组质粒构建成功。将阳性菌液送去基因测序，测序结果正确的菌液加终浓度为40%的甘油进行保菌， 80℃保存。

2.3 scFv-RBV氨基酸序列分析

利用DANMAN软件将测序结果得到的核苷酸序列翻译成氨基酸，经IMGT划分得知（图5），VH和VL序列中均有3个互补决定区（CDR）和4个框架区（ FR），且序列内无终止密码子。其中，VH基因编码118个氨基酸，位于Linker上游;VL基因编码107个氨基酸，位于Linker下游。VH和VL依靠Linker（ Gly4Ser）3相连接。

2.4 scFv蛋白理化性质及其结构预测结果

2.4.1 scFv-RBV氨基酸序列比对分析结果 利用NCBI在线分析编码scFv-RBV基因的氨基酸序列，结果发现，scFv存在抗体中的典型可变结构域（ IGV），且符合鼠源单链抗体可变区的所有特征，并与多种数据库中已登录的鼠源单链抗体有较高的同源性。其中，与Ig heavy chainV region（ PRI）-mouse（pirIA47329）同源性高达70%。

2.4.2 scFv-RBV蛋白质理化性质及二级结构预测分析结果 利用ExPASy ProtParam对scFv-RBV的理化性质分析可知，scFv-RBV编码240个氨基酸，分子式为Cl l79 Hl 795 N311 0364 S8，原子数为3657，相对分子质量为26406.57 Da，理论等电点（PI）为8.76，不稳定系数为37.79，亲水性评估值为0.372，推测该蛋白属于亲水性的稳定蛋白。二级结构预测结果表明（图6），该蛋白二级结构中无规卷曲（45.42%）和β-折叠（39.17%）占主导地位，a-螺旋（5.42%）和β-转角（10%）相对较少。

2.4.3 scFv-RBV蛋白质三级结构同源建模 经与PDB数据库进行序列比对发现，PDB ID 5kov.1所编码的氨基酸序列与scFv-RBV所编码的氨基酸序列有较高同源性（68.20%）。运用在线T具SWISS- Model进行scF-RBV的同源模型构建。图7结果表明，VH和VL主要由无规卷曲折叠形成，连接肽Linker使两者牵拉靠近，形成一个有利于抗原结合的凹槽结构，理论上具有良好的抗原结合活性。

3讨论

利巴韦林白1972年合成后，在临床上得到了长期广泛的应用，后因其导致动物中毒、免疫抑制、药物残留等危害而被国家禁用[16]。但由于其价格低廉，治疗效果好等原因，部分不法分子依然在动物养殖过程中违规使用。因此，开发便捷、高效、灵敏的检测方法迫在眉睫。在众多药物残留检测方法中，基于抗原抗体特异性结合建立的免疫分析法，由于操作简单、结果呈现快速、通量高，目前已成为检测动物源性食品中药物残留的重要手段之一，其中抗体是免疫分析法的核心试剂[17。

抗体是免疫诊断方法的基础，也是病原体检测的一个重要手段[18]。早在19世纪末期，KOHLER等[19]便利用基因工程方法制备了单克隆抗体，该制备技术的出现使规模化制备高特异性、均质性抗体成为可能，不仅为生物学和医学研究打开了新世界的大门，同时也为疾病诊断与治疗提供新工具。然而由于单克隆抗体制备过程复杂，且市场价格高昂，在一定程度上限制了其临床使用。随着基因工程抗体技术的不断发展，单链抗体以单克隆抗体衍生物的身份走进人们的视野。与传统单克隆抗体相比，单链抗体不仅保留着与亲本抗体相同的特定抗原結合特性，而且成本低、产率高、易与其他蛋白质融合形成有预期功能的抗体分子，目前已在医疗诊断、治疗和小分子化合物检测等方面推广应用[20-21]。李彤彤等[22]以抗犬细小病毒（ CPV）的杂交瘤细胞株为基础，构建的重组单链抗体具有与亲本抗体相同的免疫活性，免疫效价为1：20;陈倩等[23]基于呋喃唑酮单链抗体建立了呋喃唑酮快速检测法，相较于亲本呋喃唑酮单克隆抗体有更广的检测范围和更高的特异性和稳定性，其半数抑制浓度（ IC50）值为13.01 ng·mL-l，检出限为1.28 ng·mL-l。此外，伴随着分子生物学和生物信息学技术的不断发展，蛋白质结构预测及理化性质的详细分析也变得越来越容易。其中，同源建模法是目前用于蛋白质结构预测的常用方法之一，主要是通过与PDB数据库中目前已知序列的X射线晶体衍射做对比，而从中选取与模板具有高度保守性的氨基酸序列来构建模型。在对蛋白质三维结构进行同源建模时，要求序列的一致性至少大于30%，且序列相似度越高，结构和功能越相似[24]。而基于抗体的氨基酸序列和预测结构，对一些特定位置的氨基酸进行定向突变可用于提高抗体亲和力和特异性。张雪等[25]根据羊口疮病毒（ ORFV）单克隆抗体构建出scFv基因，成功对抗体结构进行预测分析，并进一步了解和验证互补决定区（ CDR）与ORFV的B细胞抗原表位的特异性结合的分子识别机制;曹子健等[26]通过分析构建的沙拉沙星单链抗体的序列及结构，成功构建出抗体的三维模型，并与喹诺酮类药物进行分子对接，发现色氨酸和酪氨酸是抗体与药物小分子有相互作用的关键氨基酸;谢三磊等[27]对构建的金刚烷胺单链抗体进行序列分析、模型建立和分子对接后，将关键氨基酸甘氨酸定向突变为苯丙氨酸，抗体的灵敏度较突变前提高了3.9倍;段长飞等[28]从能分泌抗阿莫西林单链抗体的杂交瘤细胞人手构建了单链抗体，通过采用生物信息学方法分析抗体序列后，将轻链互补决定区（ CDR） L3的关键氨基酸丝氨酸定向突变为天冬酰胺和谷氨酸，结果表明较突变前灵敏度分别提高了2.2倍和2.5倍。综上所述，为进一步提高抗体的亲和力和灵敏度，可以从生物信息学方法人手，通过对抗体的序列进行分析，然后对抗体进行进一步的表达和纯化及进化。从侧面反应生物信息学的理论和实验的结合可以帮助研究者更加深入的了解蛋白质的结构，为进一步明确该抗体的结构与功能的关系及其生物学活性奠定了理论基础。

4結论

本研究成功构建抗scFv-RBV基因。理化性质分析结果显示，scFv基因编码240个氨基酸，相对分子质量为26 406.57 Da，理论等电点（pl）为8.76;在二级结构中，B一折叠（39.17%）和无规卷曲（45.41%）占主导地位，a-螺旋（5.42%）和β-转角（10%）相对较少。在三级结构中，VH和VL区域相互牵拉靠近，形成典型的口袋样形状的空间构象，Linker游离于此结构之外，符合scFv的结构特点，理论上具有良好的抗原结合活性。该结果可为后续进行scFv-RBV基因的表达、纯化提供重要的参考依据，同时也为进一步进行利巴韦林单链抗体的体外进化，建立利巴韦林残留免疫快速检测方法提供强有力的理论支撑。

致谢：新乡学院动物疫病分子诊断河南省工程实验室提供实验平台，郓东光、潘鹏涛等老师对本研究予以悉心指导，李梦阳、孙梦月、李文明、李红、张艳芳、蒋力维等同学给予相关帮助，谨此致谢！

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（责任编辑：吴宇琳）

收稿日期：2021-03-10初稿;2021-07-12修改稿

作者简介：路少鹏（ 1995-），男，硕士研究生，主要从事药物代谢与药效研究（E-mail： 130990974l@qq.com）

*通信作者：王文魁（ 1962-），男，博士，教授，主要从事畜禽细胞因子研究（E-mail： wenkui2009@Veah.net）：齐永华（1977-），男，

博士，教授，主要从事细菌耐药性及新药开发研究（E-mail： qyh@xxu.educn）

基金项目：国家重点研发计划项日（ 2018YFCl602900）