王月涵，黄 颖

细胞自噬是指在生理或病理条件下，溶酶体降解自身的细胞器或者分子物质的过程。心肌细胞自噬能够促进心室重构，是导致心力衰竭的重要原因之一。但迄今为止，导致心肌细胞自噬的机制尚不明确。组蛋白去乙酰化酶3 (histone deacetylase 3, HDAC3)是表观遗传学调控的重要分子。研究表明HDAC3能够促进心肌细胞肥厚，诱导心功能不全，并和先天性心脏病有着密切关系。因此，该研究探讨HDAC3调控低氧诱导H9C2心肌细胞自噬的功能和分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

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细胞株 本实验所用大鼠H9C2心肌细胞株购自中国科学院上海细胞库。

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主要试剂 兔抗LC3B单克隆抗体、兔抗P62单克隆抗体、兔抗Beclin-1单克隆抗体、兔抗HDAC3单克隆抗体、兔抗mTOR单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体均购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体购自北京中杉金桥生物技术公司；细胞培养试剂购自美国Gibco公司。HDAC3引物序列F：5′-GATGACCAGAGTTACAAGCACC-3′；R：5′-TTGAAGCAGCCTAATCGATCAC-3′；siRNA引物序列:5′-CTGCATTATGGTCTCTATATT-3′。

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实验仪器 细胞培养箱购自美国Thermo公司；低氧小室购自加拿大Stem Cell公司；蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司；GE Amersham Imager 600自动化学发光凝胶成像分析系统购自美国GE公司。

1.2 方法

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心肌细胞低氧实验 大鼠H9C2心肌细胞用DMEM+10%FBS培养基培养，将H9C2细胞分为4组，对照组进行常氧培养，低氧组分为3组，分别是低氧1 h(1 h组)、低氧6 h(6 h组)、低氧12 h(12 h组)，然后将4组细胞放入正常恒温孵箱中培养。

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免疫荧光检测 爬满细胞的玻片以多聚甲醛固定清洗后，加入0.1% Triton X-100室温处理，然后加入牛血清白蛋白(albumin from bovine serum, BSA)，室温下封闭细胞1 h。孵育一抗，放入湿盒4 ℃冰箱过夜。避光条件下孵二抗1 h。……