黄秀， 柯甫志， 孙立方， 王平， 聂振朋， 徐建国， 孙建华

(浙江省柑橘研究所 国家柑橘品种改良浙江分中心，浙江 台州 318026)

柑橘是世界上栽培面积最大、产量最高的水果，也是我国第一大水果作物[1]。柑橘以其浓郁的风味和丰富的营养价值深受消费者的喜爱，随着我国经济的发展以及国民消费水平的提高，对柑橘的品质及品种多样性提出了更高的要求，柑橘品种的更新显得尤为重要。温州蜜柑是浙江省主栽的柑橘品种之一，改良温州蜜柑现有品种，选育出更早熟、含糖量高的温州蜜柑新品系一直是浙江柑橘育种的主要目标。通过珠心苗选育新品种是温州蜜柑育种的重要途径，但温州蜜柑类因雄性不育一般表现无核，自然状态很难形成种子[2]，给新品种选育工作增加了难度。为培育温州蜜柑珠心苗，本实验选用温州蜜柑品系由良(CitrusunshiuYura)为母本，由良属于早熟温州蜜柑类，由宫川芽变选育而来[3-4]，是近几年浙江省主要推广的品种之一，具有高糖、化渣、易剥皮、成熟期早等特性。采用有性杂交的方法，利用不同品种的花粉对由良进行授粉，培育一批由良温州蜜柑的珠心苗和杂交后代群体，并对不同授粉组合的果实坐果率、结籽率、种子发育等情况进行统计分析，研究不同品种花粉授粉对温州蜜柑结籽的影响，进而筛选出一种获取温州蜜柑后代群体的有效方法，加快温州蜜柑育种进程，培育出更多符合市场需求的新品种。

1 材料与方法

1.1 材料

实验在浙江省柑橘研究所试验站种植园进行，以树龄4 a的由良温州蜜柑为母本，父本为鸡尾葡萄柚(CitrusparadisiMacf)、四季柚(Citrusgrandis(Linn) Osbeck)、日本夏橙(2倍体)(CitrusnatsudaidaiHayata)和4倍体日本夏橙(CitrusnatsudaidaiHayata)。父本花粉取自浙江省柑橘研究所种质资源圃，用4种花粉分别对由良母本进行授粉。授粉组合为：由良×鸡尾葡萄柚；由良×四季柚；由良×日本夏橙；由良×4倍体日本夏橙；以花朵自然开放未处理的母本树为对照组，简称为CK。

1.2 杂交授粉

于2020年4月8日采集4种父本花粉。选择即将要开放的花苞带回实验室，用镊子将雄蕊取出放在培养皿中，置于25～28 ℃的环境下烘干，然后贮存在2 mL离心管中备用。4月10日在母本盛花期进行授粉，选大小、花量、长势相似的15棵由良母本树，每棵树授粉200～300朵花，每棵树为一个生物学重复，每个杂交组合设置3个生物学重复。选择花苞大但未开放的花朵，用棉签蘸取准备好的花粉轻轻涂抹在柱头上进行授粉，将杂交枝条上已经开放和未授粉的花朵摘除，统计授粉花朵数。授粉当天喷施50 mg·kg-1赤霉素保花，并套好玻璃纸袋，1周后将玻璃纸袋去掉。在第1次生理落果之前再次喷施50 mg·kg-1赤霉素保果，之后田间管理同日常。

1.3 I2-KI溶液染色法检测花粉活力

I2-KI溶液的配制：称取2 g KI溶于10 mL超纯水中，加入1 g I2，搅拌至完全溶解后定容至300 mL，存贮在棕色瓶中备用。

花粉活力测定：取1粒杂交授粉所用花粉的花药置于载玻片上，加1滴超纯水，用镊子将花药捣碎释放出花粉粒，再加2滴I2-KI溶液，小心盖上盖玻片，在电子显微镜下观察。同一视野下统计出蓝色和黄褐色的花粉粒数，1张片子查看5个不同视野，每个品种查看4张玻片，凡是被I2-KI溶液染成蓝色的为含有淀粉、活力较强的花粉粒，染成黄褐色的为发育不良的花粉粒。

1.4 杂交果实的处理

在2020年9月27日果实成熟时将杂交果实采摘带回实验室进行数据采集，统计每个杂交组合所获得的杂交果数。每个生物学重复随机选取30个果实，记录每个果实的单果重、可食率、纵径、横径、种子数，观察种子发育情况。单果种子数=种子总数/果实总数，果形指数=纵径/横径。种子发育情况分为3类：1) 饱满：种子发育完全，胚乳饱满；2) 干瘪：种子发育一般，胚乳半饱满；3) 退化：种皮存在，胚乳基本败育或完全消失，具体情况如图1所示。

图1 种子发育的情况分类

1.5 数据处理

采用Excel 2016进行数据统计和整理，采用Sigmplot软件进行数据处理，数据分析方法选用新复极差法。

2 结果与分析

2.1 不同品种的花粉活力

由表1可知，不同品种花粉活力不同，4倍体日本夏橙花粉活力最强，为72.68%；其次是日本夏橙、四季柚和鸡尾葡萄柚，分别为67.15%、61.47%和61.31%。分析得出，4倍体日本夏橙与日本夏橙相比花粉活力差异不显著，与鸡尾葡萄柚和四季柚差异达到显著水平；日本夏橙、鸡尾葡萄柚和四季柚的花粉活力差异未达到显著性水平。鸡尾葡萄柚和日本夏橙标准误较大，分别为5.57和3.48，说明其花粉个体间活力差异较大。

表1 不同品种花粉的活力差异

2.2 不同花粉授粉对由良果实坐果率的影响

不同品种花粉对由良授粉，果实坐果率差异明显(表2)。自然状态下对照组由良果实坐果率为23.37%；其余4个处理组，由良×鸡尾葡萄柚组合的坐果率较高，达到38.17%，与对照比较达到极显著差异；其次是由良×日本夏橙和由良×四季柚，坐果率分别为36.78%和33.40%，均极显著高于对照；由良×4倍体日本夏橙组合的坐果率最低，仅有24.52%，与对照差异不显著。总体来说，鸡尾葡萄柚、日本夏橙和四季柚花粉对由良授粉均能极显著提高果实坐果率，鸡尾葡萄柚授粉果实坐果率提升效果最好，4倍体日本夏橙授粉对由良果实坐果率影响不显著。

表2 不同花粉授粉对果实坐果率的影响

2.3 不同花粉授粉对由良种子形成的影响

不同花粉授粉对由良果实结籽情况影响不同(表3)。在5个组合中，由良×鸡尾葡萄柚组合获得的种子数最多，达到149粒；其次是由良×日本夏橙组合，101粒；再次是由良×四季柚组合，64粒；由良×4倍体日本夏橙组合的果实结籽较少，为32粒；对照组未得到种子。单果种子数从高至低依次为：由良×鸡尾葡萄柚组合、由良×日本夏橙组合、由良×四季柚组合、由良×4倍体日本夏橙组合、对照组。由良×鸡尾葡萄柚组合的单果种子数与由良×四季柚组合、由良×4倍体日本夏橙组合以及对照组相比，差异达到极显著水平；由良×日本夏橙和由良×四季柚组合单果种子数显著高于对照；由良×4倍体日本夏橙组合与对照差异不显著。所有组合种子胚性均为多胚。总的来说，由良在常规自然杂交条件下基本无种子形成，采用鸡尾葡萄柚花粉对由良授粉所得种子数最多，单果种子数最高。

表3 不同花粉授粉对由良种子形成的影响

2.4 不同花粉授粉对种子发育情况的影响

从表4和图2可知，不同杂交组合对种子发育情况影响不同。对照组没有得到种子，在其余4组中，由良×四季柚组合所得种子的饱满率最高，为63.49%；其次是由良×日本夏橙组合和由良×鸡尾葡萄柚组合，分别为61.56%和51.74%；由良×4倍体日本夏橙组合的种子饱满率最低，为6.67%。分析得出，由良×四季柚组合、由良×日本夏橙组合以及由良×鸡尾葡萄柚组的种子饱满率极显著高于对照组和由良×4倍体日本夏橙组合；由良×四季柚组合、由良×日本夏橙组合以及由良×鸡尾葡萄柚组合之间差异不显著性；对照组与由良×4倍体日本夏橙组合相比差异未达到显著水平。不同授粉组合对种子干瘪率的影响不同，由良×4倍体日本夏橙组合和由良×四季柚组合种子干瘪率最低，分别为2.78%和9.79%，两者相比差异不显著；由良×日本夏橙组合种子的干瘪率为20.19%，由良×鸡尾葡萄柚组合的种子干瘪率最高，为36.65%；鸡尾葡萄柚组合和夏橙组合种子干瘪率较高，可能与花粉个体间活力差异较大有关。

表4 不同花粉授粉对种子发育的影响

图2 不同花粉授粉所得的种子

不同授粉组合种子退化率，由低到高依次为：对照<由良×鸡尾葡萄柚<由良×日本夏橙<由良×四季柚<由良×4倍体日本夏橙。由良×4倍体日本夏橙组合种子退化率极显著高于其他3个组合，这可能与2倍体由良与4倍体花粉杂交产生3倍体种子，而3倍体种子多败育有关，由良×4倍体日本夏橙组中有极少数饱满种子，这部分种子可能是由良珠心细胞受4倍体日本夏橙花粉刺激产生的珠心胚；由良×鸡尾葡萄柚与由良×四季柚组合种子退化率差异显著；由良×鸡尾葡萄柚与由良×日本夏橙以及由良×四季柚与由良×日本夏橙间差异均未达到显著水平。总的来说，用鸡尾葡萄柚、日本夏橙和四季柚花粉对由良进行授粉获得的种子发育情况较好，4倍体日本夏橙花粉对由良授粉种子多退化败育。

2.5 不同花粉授粉对果实品质的影响

表5所示，由良×4倍体日本夏橙组合果实的单果重、果皮重、果皮厚在5组组合中均最高，其余组合从高至低依次为由良×日本夏橙、由良×四季柚、对照、由良×鸡尾葡萄柚。虽然各组合果实可食率略有差异，但差异未达到显著性水平。果形指数从高到低依次为：由良×鸡尾葡萄柚、由良×4倍体日本夏橙、由良×日本夏橙、由良×四季柚、对照。总体来说，授粉种子数多的组合，单果重和果皮重下降、果皮变薄，果形指数上升，可能因为鸡尾葡萄柚、四季柚花粉授粉提升了由良果实坐果率，使单个果实质量下降；4倍体日本夏橙组果实坐果率低，单个果实质量上升。

表5 不同花粉授粉对果实品质的影响

3 讨论

较多研究表明，异花授粉能影响果实坐果率。如蓝云龙等[5]研究不同品种花粉对翡翠柚授粉，不同程度的提高了果实坐果率。王绍华等[6]的研究同样得到异花授粉能提高水晶柚坐果率。本试验采用鸡尾葡萄柚、四季柚、日本夏橙和4倍体日本夏橙4种花粉对由良进行授粉，结果得到鸡尾葡萄柚、四季柚、日本夏橙花粉授粉均不同程度提高由良果实坐果率。异花授粉提高由良果实的坐果率，可能是因为人工授粉增加了柱头上附着的花粉数量，使果实的种子数增加，进而影响了果实内各种激素含量和激素间的比例[7-10]，从而提高了果实的坐果率，本研究中结籽率高的授粉组合果实坐果率也高，也相应的说明了这一点。本试验4倍体日本夏橙花粉授粉对由良果实坐果率影响不显著，可能是因为由良(2倍体)与4倍体日本夏橙花粉杂交产生3倍体，种子少，且多败育，对果实内各激素含量的影响程度低有关。

鸡尾葡萄柚、四季柚、夏橙均为2倍体花粉，3个品种花粉活力差异不显著，对由良进行授粉每个杂交组合果实结籽率和坐果率存在差异，其中以鸡尾葡萄柚花粉授粉所得果实结籽率和坐果率均最高，说明温州蜜柑品系由良结籽和坐果情况受父本品种影响较大。鸡尾葡萄柚花粉对由良授粉得到的种子总数在所有组合中最多，但种子的干瘪率亦较高，这可能与鸡尾葡萄柚花粉活力个体间差异较大有关。

从4种花粉对由良授粉以及自然杂交组合中获得果实的单果种子数和坐果率等方面考虑，本研究结果表明，对于雄性不育的温州蜜柑品系，为获得更多种子用于珠心苗培育，宜选用同为2倍体的鸡尾葡萄柚花粉进行授粉。