张维义 夏维 苑广超 王芳 江辉 范李

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)约占原发性肝癌的75%～85%。吸入麻醉剂七氟烷被广泛用于临床的肝癌手术，但对肝细胞癌的作用尚无定论[1]。糖酵解在肝癌的恶性表型维持中起着关键作用。近年来，一种新型非编码RNA BACE1-AS(BACE1 Antisense RNA)被认为参与了多种肿瘤的进展[2]。本研究通过观察七氟烷对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移以及糖酵解的影响，同时观察七氟烷对BACE1-AS表达的影响。

材料和方法

一、材料

肝癌细胞系(HepG2、Sk-Hep-1、SMMC-7721)和永生化人胎肝细胞系(L02/HL-7702)购自中国科学院上海生物科学研究所。细胞在含有10%(v/v)热灭活胎牛血清(FBS；Gibco，Gaithersburg，MD)的DMEM培养基(Thermo Fisher Science Life Sciences，Waltham，MA)培养。细胞接种于37 ℃的组织培养皿中，培养箱内含5%CO2。用4%浓度的七氟烷(Sigma，St.Louis，MO)刺激细胞24小时。

二、方法

1.细胞增殖检测：用CCK-8(Dojindo公司)检测肝癌细胞细胞增殖率。将细胞播种到96孔板中，经七氟烷刺激后，每孔加入CCK-8溶液，37 ℃、95%空气和5%CO2的湿化气氛中孵育1小时。用微板阅读器(Bio-Rad，Hercules，CA)在450 nm处检测吸光度。实验重复3次。

2.细胞凋亡检测：细胞经过七氟烷刺激后，用Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)凋亡检测试剂盒按照制造商的描述检测细胞凋亡进程。在50 μg/ml核糖核酸酶A(SIGMA)存在下，用Annexin V-FITC/碘化丙啶(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide)在黑暗中对细胞进行染色。随后，在FACScan流式细胞仪(Beckman Coulter，Fullerton，CA)上检测细胞凋亡结果，实验重复3次。

3.Transwell侵袭和迁移实验：将1 000个细胞接种到六孔板中，并在含有10% FBS的1640培养基中培养。将乳腺癌细胞用4%多聚甲醛固定30分钟，用0.1%结晶紫染色30分钟。手工计数可见克隆数。将悬浮细胞加入含有1%胎牛血清的上室，而下室含有10%胎牛血清。孵育后，将侵入下腔的细胞固定，显微镜下染色计数。……