张维义 夏维 苑广超 王芳 江辉 范李

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)约占原发性肝癌的75%～85%。吸入麻醉剂七氟烷被广泛用于临床的肝癌手术，但对肝细胞癌的作用尚无定论[1]。糖酵解在肝癌的恶性表型维持中起着关键作用。近年来，一种新型非编码RNA BACE1-AS(BACE1 Antisense RNA)被认为参与了多种肿瘤的进展[2]。本研究通过观察七氟烷对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移以及糖酵解的影响，同时观察七氟烷对BACE1-AS表达的影响。

材料和方法

一、材料

肝癌细胞系(HepG2、Sk-Hep-1、SMMC-7721)和永生化人胎肝细胞系(L02/HL-7702)购自中国科学院上海生物科学研究所。细胞在含有10%(v/v)热灭活胎牛血清(FBS；Gibco，Gaithersburg，MD)的DMEM培养基(Thermo Fisher Science Life Sciences，Waltham，MA)培养。细胞接种于37 ℃的组织培养皿中，培养箱内含5%CO2。用4%浓度的七氟烷(Sigma，St.Louis，MO)刺激细胞24小时。

二、方法

1.细胞增殖检测：用CCK-8(Dojindo公司)检测肝癌细胞细胞增殖率。将细胞播种到96孔板中，经七氟烷刺激后，每孔加入CCK-8溶液，37 ℃、95%空气和5%CO2的湿化气氛中孵育1小时。用微板阅读器(Bio-Rad，Hercules，CA)在450 nm处检测吸光度。实验重复3次。

2.细胞凋亡检测：细胞经过七氟烷刺激后，用Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)凋亡检测试剂盒按照制造商的描述检测细胞凋亡进程。在50 μg/ml核糖核酸酶A(SIGMA)存在下，用Annexin V-FITC/碘化丙啶(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide)在黑暗中对细胞进行染色。随后，在FACScan流式细胞仪(Beckman Coulter，Fullerton，CA)上检测细胞凋亡结果，实验重复3次。

3.Transwell侵袭和迁移实验：将1 000个细胞接种到六孔板中，并在含有10% FBS的1640培养基中培养。将乳腺癌细胞用4%多聚甲醛固定30分钟，用0.1%结晶紫染色30分钟。手工计数可见克隆数。将悬浮细胞加入含有1%胎牛血清的上室，而下室含有10%胎牛血清。孵育后，将侵入下腔的细胞固定，显微镜下染色计数。上室加入基质胶后，将100 μl含有1%胎牛血清的培养基悬浮的乳腺癌细胞加入上室，下室含有10%胎牛血清。孵育后，将侵入小室的细胞固定，显微镜下染色计数。

4.细胞划痕实验：待六孔板里的细胞铺满后，用枪头垂直于孔板制造细胞划痕，将细胞接种与中间区域然后培养，带细胞长满区域后用镊子移除既可以观察到划痕。

5.生物信息学：利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库对BACE1-AS的相关生物学信息进行挖掘，包括肝癌组织中的表达量，预后相关分析等。

三、统计学处理

使用GraphPad Prism 8.0软件(GraphPad Software，California)进行统计分析。比较结果使用非配对双尾t检验或单方差分析，然后进行Bonferroni后检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.七氟烷对肝癌细胞增殖和凋亡的影响：与未处理细胞比较，七氟烷刺激明显降低HepG2细胞的存活率(P<0.05，图1A)。此外，我们观察到七氟烷是一种有效的促凋亡因子(P<0.05，图1B)。以上结果表明，七氟烷可以抑制肝癌细胞的生长，同时具有促进肝癌细胞凋亡的特性。

2.七氟烷对肝癌细胞侵袭迁移的影响：Transwell实验表明，与未处理细胞比较，七氟烷刺激明显降低HepG2细胞的侵袭力(P<0.05，图2A)。此外，划痕实验表明，经过七氟烷处理，HepG2细胞的迁移能力下降，差异有统计学意义(P<0.05，图2B)。以上结果表明，七氟烷可以抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。

3.七氟烷对肝癌细胞糖酵解的影响：与未处理细胞比较，七氟烷刺激降低HepG2细胞的葡萄糖摄取以及乳酸生成(P<0.05，图3A)。此外，经过七氟烷处理，HepG2细胞的细胞外酸化(ECAR)明显下降，而耗氧量(OCR)明显上升，差异有统计学意义(P<0.05，图3B)。以上结果表明，七氟烷可以抑制肝癌细胞的糖酵解。

4.七氟烷降低癌基因BACE1-AS的表达：研究表明，非编码RNA BACE1-AS是多种肿瘤的癌基因。我们通过挖掘TCGA数据库发现，BACE1-AS在肝癌组织中的表达均高于对照组织，差异有统计学意义(P<0.05，图4A)。此外，高表达BACE1-AS的肝癌病人生存期明显更短，风险比达1.75，差异有统计学意义(P<0.05，图4B)。另外，BACE1-AS在3种肝癌细胞中的表达高于正常肝细胞(P<0.05，图4C)，而经过七氟烷处理后，肝癌细胞BACE1-AS的表达降低(P<0.05，图4D)。结果表明，BACE1-AS是一个肝细胞癌癌基因，七氟烷可以抑制其表达。

A：七氟烷抑制肝癌细胞的增殖；B：七氟烷促进肝癌细胞的凋亡

A：七氟烷抑制肝癌细胞的侵袭；B：七氟烷抑制肝癌细胞的迁移

讨论

七氟烷是临床上一种常用挥发性麻醉剂。有研究表明，七氟烷在许多人类癌症中显示出抗癌活性。如，七氟烷通过抑制丝裂原相关蛋白激酶途径的激活来抑制肺癌细胞的侵袭[3]。研究发现，七氟烷通过诱导A549细胞凋亡来抑制增殖[4]。同时七氟烷通过下调MMP9在体外降低结肠癌细胞的侵袭力[5]。此外，七氟烷通过抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1a)而抑制缺氧诱导的肺癌细胞生长和转移[6]。七氟烷对胶质瘤细胞的迁移和MMP-2活性有抑制作用[7]。然而，很少有报道涉及七氟烷在肝癌中的作用。本研究结果表明，七氟烷明显抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移，同时促进其凋亡。

A：七氟烷降低HepG2细胞的葡萄糖摄取以及乳酸的生成；B：经过七氟烷处理，HepG2细胞的细胞外酸化(ECAR)明显下降，而耗氧量(OCR)明显上升

A：BACE1-AS在肝癌组织中高表达；B：高表达BACE1-AS提示较差的预后；C：BACE1-AS在肝细胞癌细胞系中高表达；D：七氟烷可以降低BACE1-AS的表达

目前最新观点认为肿瘤细胞即使在充足的氧气条件下也倾向于将葡萄糖转化为乳酸，这种现象被称为有氧糖酵解或Warburg效应，其特征是葡萄糖摄取和乳酸生成增加，细胞外酸化率的增加，而耗氧量降低[8]。在肝癌的进展过程中，有氧糖酵解可以促进恶性表型，乳酸的产生为肝癌的侵袭和转移提供了酸性环境[9]；有氧糖酵解的增加也与索拉非尼耐药有关[10]。因此，糖酵解是肝癌细胞一个显著的特征，也是潜在的治疗靶点。我们的研究结果表明，经过七氟烷处理后，HepG2细胞的葡萄糖摄取以及乳酸的生成明显下降，细胞外酸化明显下降，而耗氧量明显上升，提示七氟烷可以逆转肝癌细胞的有氧糖酵解。

长非编码RNA(Long Non-Coding RNAs，LncRNAs)是一组长度超过200个核苷酸的非编码RNA，已被报道参与包括肝癌在内的人类肿瘤相关。例如，lncRNA RHPN1-AS1(RHPN1 Antisense RNA 1)通过阻断miR-596对IGF2BP2(Insulin Like Growth Factor 2 MRNA Binding Protein 2)表达的抑制来推动肝癌的进展[11]。LncRNA SSTR5-AS1(SSTR5 Antisense RNA 1)参与了HBV相关肝癌的发展[12]。近年来，一种新型非编码RNA BACE1-AS(BACE1 Antisense RNA)被认为参与了多种肿瘤的进展[13]。本研究结果表明，BACE1-AS是一个肝细胞癌相关癌基因，经过七氟烷处理后，肝癌细胞BACE1-AS的表达明显降低。

本研究总结了七氟烷在调节BACE1-AS通路中的新作用，并在体外发挥其抗肿瘤活性。然而，本研究还存在一定的局限性，还需要更多的体内实验来证实BACE1-AS介导的七氟烷在肝癌中的抗肿瘤活性，以及BACE1-AS下游的分子靶点及具体机制。

综上所述，七氟烷可能通过下调BACE1-AS的表达，抑制肝癌细胞的增殖、侵袭迁移和糖酵解，同时促进其凋亡，从而发挥其抗肿瘤作用。