刘海港，孙立栋，宋檀婧

华中科技大学基础医学院生物化学与分子生物学系，武汉 430030

组蛋白赖氨酸去甲基化酶1A[lysine(K)-specific demethylase 1A，KDM1A或LSD1]是最早被发现的催化组蛋白赖氨酸去甲基化的酶类[1]。在此之前人们普遍对组蛋白赖氨酸是否存在去甲基化修饰存在争议，该酶的发现揭示了组蛋白赖氨酸去甲基化修饰机制的存在，同时也佐证了组蛋白的甲基化修饰是动态的，而非不可逆的。目前已经有约20种组蛋白去甲基化酶被发现，能够催化包括H3K4，H3K9，H3K27，H3K36和H4K20等多种位点在内的组蛋白去甲基化。

1 LSD1的结构和生理功能

Nagase等[2]于1998年最早克隆出了KDM1A基因，该基因位于1号染色体短臂上，全长64249 bp，包含19个外显子和18个内含子，能够编码886个氨基酸。RT-PCR结果显示，除了胰腺和脾脏外，LSD1在全身几乎所有组织中均有表达，并且在肾脏和睾丸组织中表达最高。

LSD1是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖的胺氧化酶家族的一员，可以通过辅基FAD催化氧化反应特异性脱去组蛋白H3第4位的赖氨酸(H3K4)和H3第9位赖氨酸(H3K9)的一甲基化和二甲基化的甲基，但不能脱去三甲基化的甲基[1]。LSD1主要由3个结构域构成，N端的SWIRM结构域、C端的AOL结构域以及中央伸出的Tower结构域(图1)。SWIRM有利于维持LSD1的稳定性，并且和AOL结构域存在广泛的相互作用，形成大约1600 nm2的接触面。Tower结构域是从AOL结构域中央伸出的两个反向平行的α螺旋，将AOL结构域分成两个部分。AOL结构域也包含两个子域，分别是底物结合域和FAD结合域[3]。

图1 LSD1的晶体结构(PDB ID：2HKO)Fig.1 The crystal structure of LSD1(PDB ID：2HKO)

LSD1在细胞内通常和CoREST、BHC80以及HDAC1/2等LSD1相关蛋白构成转录共抑制复合物。这些LSD1相关蛋白参与调节LSD1的活性，其中CoREST的SANT2结构域和LSD1的Tower结构域相互结合使得LSD1更稳定，同时CoREST也能通过SANT2结构域结合核小体上的DNA，从而使LSD1能够催化以核小体为底物的去甲基化反应[4]。Wang等[5]发现LSD1还存在于核小体重塑和去乙酰化酶(NuRD)复合体内。在复合体内，LSD1的Tower结构域可以与NuRD复合体内的转移性肿瘤抗原1-3(MTA1-3)直接结合，而MTA1-3上也存在SANT结构域，可以协助LSD1锚定在核小体上，从而发挥与CoREST类似的作用。

作为特异性催化H3K4me1/2和H3K9me1/2的组蛋白赖氨酸去甲基化酶，LSD1对组蛋白H3去甲基化修饰后引起的下游生物学效应取决于组蛋白赖氨酸的甲基化修饰对基因转录的作用是激活还是抑制，其中H3K4甲基化多数情况下会激活相关基因转录，而H3K9的甲基化修饰则一般会抑制基因转录[6]。例如，使用胺氧化酶抑制剂Pargyline抑制LSD1的去甲基化酶活性，可以观察到前列腺特异抗原(prostate-specific antigen，PSA)基因启动子区域H3K9甲基化水平升高以及PSA表达量降低[7]。对秀丽隐杆线虫的研究也表明，H3K4去甲基化会导致细胞衰老的相关基因沉默[8]。

LSD1还能与雄激素受体(androgen receptor，AR)结合，促进雄激素受体依赖的基因表达。首先，雄激素(配体)和AR的结合导致AR发生细胞核转位，定位到AR靶基因的雄激素反应元件上。在细胞核内，LSD1与AR共同构成染色质相关功能复合物来催化位于靶基因启动子区域的H3K9一甲基化和二甲基化的脱甲基化反应[9]。

此外，LSD1能使DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，Dnmt)去甲基化，同时起到稳定Dnmt1的作用[10]。Dnmt1是一种重要的DNA甲基转移酶，具有催化DNA甲基化的作用。因而LSD1有利于DNA的甲基化，从而导致基因转录抑制。

2 人体胚胎干细胞介绍

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)分离于囊胚期的内细胞团，具有多潜能性和自我更新的能力。在一定条件下，人ESC能分化为体内三胚层来源的任何细胞。ESC自我更新能力和多能性的维持依赖于复杂的信号转导通路和转录因子构成的转录调控网络，其中Oct4、Sox2和Nanog等转录因子在转录调控网络中处于核心地位[11]。研究表明，表观遗传调控在胚胎干细胞的自我更新和分化过程中也发挥着重要的功能，胚胎干细胞分化过程中的表观遗传学机制已成为干细胞领域一个新的研究热点[12]。

3 表观遗传修饰与胚胎干细胞分化

表观遗传修饰是指DNA序列保持不变而基因表达发生可遗传的变异的现象。表观遗传变化主要包括DNA的修饰、组蛋白的修饰、非编码RNA作用和染色质重塑等。表观遗传变化的产生是环境和细胞内遗传物质相互作用的结果，最终体现在基因表达的变化上，产生基因沉默、休眠转座子激活、基因印记和核仁显性等生物学效应[13]。众多研究表明，肿瘤发生发展、衰老以及胚胎发育等生命过程都受到表观遗传的调控[14-16]。

3.1 DNA甲基化与胚胎干细胞分化

DNA甲基化是目前研究得最深入的DNA共价修饰类型。DNA甲基化是在Dnmt的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基共价结合到DNA胞嘧啶的第5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶的过程，常于CpG岛处发生。DNA甲基化能直接遏制转录因子与靶基因的结合，抑制基因转录；除此之外甲基化结合蛋白会通过甲基化DNA结合结构域结合在DNA上，这些蛋白同时是转录抑制因子，能诱导染色体状态的改变，从而抑制基因的转录[17]。

DNA甲基化在胚胎干细胞分化中起重要的调控作用，基因组甲基化的异常会导致严重的胚胎发育障碍[18]。在生殖细胞形成和早期胚胎形成期，生殖细胞和胚胎细胞基因组分别发生一次整体水平的去甲基化后重新甲基化，称为DNA甲基化重编程。发生于配子形成期的DNA甲基化重编程的目的是使亲代印迹基因被去除再重新确立；发生于早期胚胎形成时期的DNA甲基化重编程对受精卵获得全能性并产生新个体是至关重要的[19]。Shen等[20]研究发现，在胚胎干细胞向神经祖细胞分化的过程中，大约有1.4%的CpG岛区域发生了显著的DNA重新甲基化过程。胚胎干细胞的定向分化过程也受到DNA甲基化水平的调控。Singh等[21]在造血干细胞分化过程中检测到珠蛋白基因启动子区域发生去甲基化。Yoon等[22]发现用具有强烈甲基化酶抑制效应的试剂可以诱导人胚胎干细胞向心肌细胞分化。

3.2 组蛋白甲基化与胚胎干细胞分化

组蛋白修饰常发生在组蛋白尾部的赖氨酸和精氨酸残基上，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等多种共价修饰类型。乙酰化和甲基化是最主要、最常见的组蛋白修饰类型，参与组蛋白甲基化和乙酰化修饰的酶分别是组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase，HMT)和组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase，HAT)。组蛋白N端特异性残基的乙酰化可以削弱DNA和组蛋白之间的相互作用，使浓缩的染色质结构变得松散，基因转录活性增强。组蛋白甲基化主要发生在组蛋白H3、H4的N端赖氨酸和精氨酸残基上，其中组蛋白赖氨酸的甲基化残基总共有6种(H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79、H4K20)，且均能被单甲基化、二甲基化和三甲基化。组蛋白赖氨酸甲基化的生物学效应比较复杂，取决于发生甲基化的位点和甲基化的程度，可以是转录激活，也可以是转录抑制。

目前已有较多的研究表明组蛋白的甲基化在胚胎干细胞多潜能特性的维持中发挥着重要的作用[23]。ESC为了维持其多潜能性必须抑制分化基因表达，二价染色体区域的建立有助于这一过程。胚胎干细胞细胞核内的二价染色体区域是指抑制基因表达的H3K27me3修饰和激活基因表达的H3K4me3共同存在的区域。分化相关基因的H3K27me3修饰丢失和H3K4me3修饰保留会促进分化基因转录激活从而导致胚胎干细胞沿一定方向分化。当分化方向确定后，其他分化基因H3K27me3修饰的保留和H3K4me3修饰丢失则会抑制这些基因表达，胚胎干细胞向其他方向的分化也被关闭[24-25]。通常情况下，在二价染色体区域H3K27me3的抑制效应要强于H3K4me3的激活效应，所以二价染色体区域的作用是沉默分化相关基因[24]。

4 LSD1在胚胎干细胞分化中的作用

胚胎干细胞的分化过程依赖于两类基因表达的协同调节，分别是谱系特异基因表达的激活和多潜能性基因(pluripotency genes，PpGs)表达的抑制。Lsd1-Mi2/NuRD复合物能沉默PpGs的增强子从而抑制多潜能性基因的表达、调控胚胎干细胞的分化过程。Petell等[26]深入研究了Lsd1-Mi2/NuRD复合物作为胚胎干细胞分化的动态调节开关在诱导组蛋白尾部和Dnmt3的ADD结构域局部相互作用导致PpGs启动子区域DNA甲基化的机制。组蛋白尾部未甲基化的H3K4与Dnmt3a ADD结构域的相互作用能激活Dnmt3a的催化活性，引起PpGs增强子区域DNA的甲基化。这种相互作用能够被H3K4一甲基化和组蛋白乙酰化所阻断[27]。因此，LSD1与Mi2/NuRD去乙酰化复合物的相互作用导致了H3K4me1的去甲基化和H3K27ac的去乙酰化，引起Dnmt3a的激活，从而提高了PpG基因增强子区域的DNA甲基化水平，抑制PpG基因的增强子活化和转录激活。

除此之外，一种组蛋白甲基转移酶Mll4能够被特异性募集到目标染色质的增强子区域，这种募集过程在胚胎干细胞由原始态多能性向始发态多能性的转换中发挥着必不可少的作用[28]。研究表明，LSD1与Mll4共定位于染色质上相同的增强子区域，并且在Mll4敲除的胚胎干细胞内，LSD1能够结合到基因的增强子上，引起H3K4me1去甲基化，解除增强子的功能，从而导致基因转录抑制和胚胎干细胞多能性状态转换失败[28]。而靶向LSD1的基因敲低在很大程度上恢复了Mll4敲除的胚胎干细胞中的转录失调，表明Mll4缺失引起的多能性转变中的转录缺陷依赖于LSD1的组蛋白表观遗传修饰功能。

Guo等[29]研究发现LSD1通过介导GATA-2转录因子的抑制在胚胎干细胞和造血干(祖)细胞红系分化中发挥着至关重要的作用。GATA-1和GATA-2是调节造血谱系分化的重要转录因子，尤其是在红系分化中起关键性的作用。在干细胞红系分化过程中，LSD1被TAL1募集到GATA-2基因座位上并发挥去甲基化酶活性引起GATA-2基因座附近H3K4me2水平降低，从而抑制了GATA-2基因的转录。研究者们在胚胎干细胞内用shRNA介导的基因沉默技术敲低LSD1，然后用促红细胞生成素诱导其分化。随后的检测结果显示，和对照组相比，LSD1敲低的胚胎干细胞出现了红系造血分化被抑制的现象。

曾经有文献报道LSD1在干细胞发育的多个阶段的表型转换点都是不可或缺的，其中就包括脂肪组织的形成[30]。Xiong等[31]为了深入探究LSD1在人类胚胎干细胞向脂肪组织分化中的作用，用不同浓度的LSD1的抑制剂CBB1007处理人类胚胎干细胞，观察胚胎干细胞被诱导因子诱导向脂肪组织分化的情况。研究者在实验中检测到随着LSD1抑制剂CBB1007浓度的增加，胚胎干细胞脂肪分化的效率也会提升。这说明在胚胎干细胞脂肪分化的过程中，LSD1的抑制能够促进脂肪组织的生成。研究者们还发现LSD1的抑制导致了组蛋白H3K4me2水平和PPARγ和C/EBPα表达水平的升高。PPARγ和C/EBPα是调控人类胚胎干细胞向脂肪组织分化的主要转录因子，它们的启动子区域存在H3K4me2[32]。这些结果表明LSD1的抑制可能通过增加PPARγ和C/EBPα启动子区域H3K4me2水平，促进PPARγ和C/EBPα基因的表达，从而导致脂肪组织形成。

有研究表明LSD1的减少会导致Sox2，Oct4等在胚胎干细胞自我更新和全能性的维持中起重要作用的转录因子的转录水平下调，从而抑制具有全能性的胚胎干细胞的自我更新[33-34]。在鼠胚胎干细胞内，SET7甲基转移酶催化Sox2第119位的赖氨酸的单甲基化修饰过程，引发了泛素依赖的Sox2蛋白水解作用[35]。Zhang等[36]研究表明LSD1作为去甲基化酶能够去除Sox2蛋白上的多种甲基化基团，从而抑制Sox2甲基化引起的泛素依赖的蛋白水解过程。研究者们进一步的实验发现LSD1的下调会促进Sox2蛋白水解，但是这种作用会被SET7的失活所阻断。这项结果证实了SET7和LSD1可以通过催化Sox2蛋白特异位点发生甲基化或者去甲基化，从而影响Sox2的稳定性，并进而在胚胎干细胞自我更新和全能性的维持中发挥调节作用。

Vinckier等[37]的研究表明，在胚胎干细胞向组织细胞分化发育的过程中会受到很多分化信号的诱导和调节，每一种分化信号作用一段时间后就必须终止，否则会影响细胞下一个阶段的诱导分化。例如，在胰腺内分泌细胞分化的过程中需要视黄酸这一信号的诱导，从而引起相关基因增强子激活和表达水平升高。而LSD1则能通过解除增强子的功能使得被视黄酸信号诱导激活的基因沉默，从而及时终止视黄酸信号对细胞分化的诱导作用，促进细胞转换到下一个分化阶段。研究者观察到，当LSD1活性被抑制后，被视黄酸诱导激活的基因不能被沉默，即使此时去除视黄酸这一诱导信号，细胞仍然不能过渡到下一个分化阶段。这证明了LSD1在调控分化信号诱导的细胞转录水平改变中的重要作用。

He等[38]研究发现LSD1的抑制能促进胚胎干细胞向胰岛素生成细胞(insulin producing cell，IPC)分化并帮助IPC成熟。该研究采用适当的诱导技术从人胚胎干细胞H9细胞系中诱导产生IPC，并且通过慢病毒载体介导的shRNA技术降低LSD1表达水平。接下来研究者们观察到LSD1的mRNA水平降低以及LSD1蛋白表达量在干细胞向IPC分化的过程中逐渐减少。为了探究LSD1调控人胚胎干细胞向IPC分化的具体机制，研究者们用Western blot检测了分化过程各时期关键的信号通路蛋白表达水平的改变。其中，ERK信号通路在分化过程中持续激活。并且在用shRNA敲低LSD1的分化细胞中，总的ERK表达水平被检测到剧烈减少，而磷酸化ERK水平明显升高。在用LSD1的抑制剂TCP处理的细胞中也观察到了这样的结果。许多文献报道ERK/MAPK信号通路对胚胎干细胞的分化调控十分关键[39-40]。例如，Kim等[39]曾证明ERK介导的Nanog磷酸化通过影响Nanog蛋白的稳定性在胚胎干细胞的自我更新中发挥着重要作用。总之，研究者还通过后续一系列实验证实了LSD1的抑制通过引起ERK信号通路激活促进人胚胎干细胞向IPC分化的机制。

5 总结和展望

综合以上所述不难发现，LSD1调控胚胎干细胞分化的一般模式是通过影响分化关键基因启动子区域的甲基化水平，继而调节转录水平，最终导致分化的增强或是抑制。总之，LSD1在胚胎发育尤其是胚胎干细胞的分化发育中发挥着重要的调控作用。胚胎干细胞未分化状态的维持、分化方向的决定都有赖于LSD1的脱甲基化机制。对LSD1的研究，将有助于进一步阐明表观遗传学在胚胎干细胞自我更新和分化中的调控机制，为胚胎干细胞临床应用奠定基础。

然而，目前的研究成果主要集中在LSD1通过催化H3K4的去甲基化调控胚胎干细胞分化，对于LSD1催化H3K9去甲基化对胚胎干细胞发育的影响很少述及。除此之外，其他非组蛋白如p53等也能作为LSD1的去甲基化底物。非组蛋白底物的甲基化水平改变是否会影响胚胎干细胞分化进程仍有待进一步的研究。