吴 婧，唐晓婷，房太勇

福建医科大学附属第二医院消化内科，泉州 362000

胃癌的发病率与死亡率呈逐年上升的趋势，且位于我国恶性肿瘤死亡率的第2位。胃癌早期患者无明显特异性症状，确诊时常已处于进展期，胃癌患者5年生存率低于30%，目前临床常用的辅助诊疗的肿瘤标志物特异性与敏感性较弱[1]。环状RNA(circRNA)在胃癌等多种疾病中发挥重要作用，其主要是由RNA剪接产生的共价闭合环状RNA分子，外显子与内含子组成的circRNA是其主要结构类型。越来越多的研究表明circRNA在胃癌中表达异常，并可调控细胞增殖及凋亡等生物学过程[2-4]。circFARSA在非小细胞肺癌组织与细胞系中表达水平升高，是主要来自FARSA基因外显子5-7的一种circRNA，其可促进非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭[5]。miR-671-5p在胃癌细胞中的表达水平降低，miR-671-5p通过靶向细胞增殖上调因子(URGCP)抑制胃癌细胞增殖并促进细胞凋亡[6]。但circFARSA/miR-671-5p分子轴是否参与胃癌发生及发展进程尚未可知。本研究主要探讨circFARSA是否可通过靶向调控miR-671-5p而影响胃癌细胞生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

收集2019年2月至2020年2月于福建医科大学附属第二医院胃肠外科进行胃癌根治术的40例胃癌患者组织标本。于标本切除后立即采集胃癌组织与癌旁组织(距离癌组织5 cm以上)，包括23例男性与17例女性，平均年龄为(55.78±6.71)岁。本研究流程遵循《赫尔辛基宣言》中的标准，已通过审核部门的批准。DMEM培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；人胃癌细胞AGS购自上海生博生物公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；从北京全式金生物技术有限公司购进TRIzol试剂；从北京天根生化科技有限公购进荧光定量PCR试剂、逆转录试剂；si-NC、si-circFARSA、miR-NC、miR-671-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-671-5p购自广州锐博生物公司；MTT试剂、Matrigel基质胶、Transwell小室购自北京索莱宝公司；兔抗人MMP-2、MMP-9一抗与二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 胃癌细胞AGS消化后种植于24孔板，当细胞汇合度达到50%时将对数生长期AGS细胞置于无血清的培养液中，培养24 h后，细胞汇合度达到80%左右时随机分为si-NC组(加circFARSA小干扰RNA的阴性对照物)、si-circFARSA组(加circFARSA小干扰RNA)、si-circFARSA+anti-miR-NC组(加circFARSA小干扰RNA与miR-671-5p抑制剂的阴性对照物)、si-circFARSA+anti-miR-671-5p组(加circFARSA小干扰RNA与miR-671-5p抑制剂)。将上述转染物分别溶解于Opti-MEM减血清培养液中，加入Lipofectamine2000试剂混合后室温孵育20 min，加入细胞培养板中孵育6 h，再将其转移至正常细胞培养液中培养48 h。

1.2.2 qRT-PCR检测circFARSA、miR-671-5p的表达水平 取癌旁组织、胃癌组织与经过处理的AGS细胞，提取总RNA，该过程严格按照TRIzol试剂说明书进行操作。再进行逆转录反应合成cDNA，反转录体系：RNA 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，Multiscripe RT 1 μL，10×Random Primer 2 μL，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μL；反应条件：25℃ 10 min，37 ℃ 60 min，95℃ 5 min，4 ℃保存。cDNA作为qRT-PCR的模板，SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O补足体系至20 μL；反应条件：95℃预变性5 min循环1次，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环40次。根据荧光定量PCR试剂盒说明书操作，并对circFARSA、miR-671-5p的相对表达量进行测定。circFARSA正向引物5′-GCTCCTTCTGGAACTTTGAC-3′，反向引物5′-TTGCTCACCCAGTAGGTCTT-3′；miR-671-5p正向引物5′-GCCCGCAGGAAGCCCTGGAGGGGC-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCCGAGGT-3′；GAPDH正向引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.2.3 MTT法测定细胞增殖水平 在转染6 h后分别对各组AGS细胞进行接种，按照每孔1×103个接种于96孔板中，加入Opti-MEM减血清培养液共100 μL后继续培养，48 h后分别加入MTT溶液20 μL，置于培养箱内继续培养4 h后弃上清液，添加DMSO 150 μL，在室温以及避光条件下充分振荡后进行孵育，5 min后采用酶标仪测定各孔在490 nm的吸光度值(A)。

1.2.4 检测细胞周期 用胰蛋白酶消化各组AGS细胞后制备单细胞悬液(2.5×105个/mL)，置于PBS溶液中反复洗涤，加入70%无水乙醇进行固定处理，12 h后添加450 μL PI并在室温以及避光条件下进行孵育，30 min后采用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5 划痕实验 在6孔板背面划线，每孔中分别加入各组AGS细胞(2×103个/孔)，待细胞铺满后用无菌移液枪头在细胞中划线(垂直于平行线)，冲洗散落的细胞后继续培养，以平行线与划痕的交点为观察点，在0 h、24 h时定点拍照记录并计算迁移距离。

1.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭 将各组处理后的AGS细胞加入预先铺制Matrigel基质胶稀释液的小室上室(1×104个/孔)，其中无血清培养液使用量为100 μL，将600 μL含有10%胎牛血清的培养液加入下室，24 h后取出并置于PBS溶液中重复洗涤3次，采用甲醛进行固定处理，20 min后滴加0.1%结晶紫染液进行染色，15 min后置于显微镜下拍照观察以及计数。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测circFARSA与miR-671-5p的靶向关系 完成野生型载体WT-circFARSA(含有结合位点)的构建工作，结合位点突变与基因点突变技术完成突变型载体MUT-circFARSA(含有突变位点)的构建工作。在AGS细胞中分别共转染miR-NC与WT-circFARSA、miR-NC与MUT-circFARSA、miR-671-5p mmics与WT-circFARSA以及miR-671-5p mmics与MUT-circFARSA，应用双荧光素酶活性检测试剂盒对共转染24 h后细胞的荧光素酶活性进行测定。

1.2.8 Western blot检测MMP-2、MMP-9蛋白表达 在各组AGS细胞中加入RIPA裂解液，裂解细胞后进行细胞总蛋白提取，取50 μg蛋白样本进行SDS-PAGE电泳反应，反应条件：80 V 30 min，120 V 90 min，将其转移至PVDF膜，PVDF膜置于5%脱脂奶粉中孵育2 h，分别转移至MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)与内参GAPDH(1∶1000)一抗稀释液中，在4℃条件下孵育24 h，TBST洗涤，将其加入二抗稀释液(1∶2000)中，在37 ℃条件下孵育1 h，测定观察各条带的灰度值，软件为Image J。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 胃癌组织、癌旁组织中的miR-671-5p、circFARSA表达水平差异比较

circFARSA在胃癌组织中的表达量远高于癌旁组织，且miR-671-5p呈低表达，数值远低于癌旁组织，数据差异均存在统计学意义(均P<0.05)，见图1A。Pearson法分析胃癌组织中circFARSA与miR-671-5p表达量的相关性。结果显示，circFARSA与miR-671-5p表达呈负相关(r=-0.6374，P<0.01)，见图1B。

A：circFARSA与miR-671-5p的表达量；B：circFARSA与miR-671-5p表达量的相关性分析；与癌旁组织比较，*P<0.05图1 circFARSA与miR-671-5p在胃癌组织中的表达量Fig.1 Expression levels of circFARSA and miR-671-5p in gastric cancer tissues

2.2 干扰circFARSA对胃癌细胞AGS活力与细胞周期的影响

与si-NC组比较，si-circFARSA组circFARSA的表达量降低(P<0.05)，见图2A。表明转染效果良好。与si-NC组比较，si-circFARSA组细胞活力降低(P<0.05)，见图2B；G0/G1期细胞比例升高(P<0.05)，S期细胞比例降低(P<0.05)，G2/M期细胞比例比较差异无统计学意义，见图2C。

A：qRT-PCR实验检测circFARSA干扰效果；B：MTT法检测细胞活力；C：流式细胞仪检测细胞周期；与si-NC组比较，*P<0.05图2 干扰circFARSA对胃癌细胞AGS活力与细胞周期的影响Fig.2 Effect of interference with circFARSA on the viability and cell cycle of gastric cancer cell AGS

2.3 干扰circFARSA对胃癌细胞AGS迁移及侵袭的影响

与si-NC组比较，si-circFARSA组细胞迁移距离与侵袭细胞数量均显著减少，其MMP-2、MMP-9蛋白呈低水平表达，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图3。

A：划痕实验与Transwell实验分别检测细胞迁移及侵袭；B：Western blot法检测蛋白相对表达量；与si-NC组比较，*P<0.05图3 干扰circFARSA对胃癌细胞AGS迁移及侵袭的影响Fig.3 Effect of interference with circFARSA on the migration and invasion of gastric cancer cell AGS

2.4 circFARSA靶向调控miR-671-5p

circFARSA与miR-671-5p存在结合位点，见图4A。miR-671-5p过表达可明显降低共转染WT-circFARSA质粒的AGS细胞的荧光素酶活性(P<0.05)，见图4B。

circFARSA可负向调控miR-671-5p的表达(P<0.05)，见图4C。

A：circFARSA与miR-671-5p存在结合位点；B：双荧光素酶报告实验检测结果；C：qRT-PCR法检测miR-671-5p的表达量；与miR-NC组比较，*P<0.05；与pcDNA组相比，#P<0.05；与si-NC组比较，△P<0.05图4 circFARSA靶向调控miR-671-5pFig.4 circFARSA targetd and regulated miR-671-5p

2.5 circFARSA表达下调对AGS细胞增殖、迁移、侵袭过程的影响可通过抑制miR-671-5p表达逆转

与si-circFARSA+anti-miR-NC组比较，si-circFARSA+anti-miR-671-5p组相对表达量降低(P<0.05)，细胞活力升高(P<0.05)，G0/G1期细胞比例降低(P<0.05)，S期细胞比例升高(P<0.05)，迁移距离、侵袭细胞数均明显增加(均P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白均呈高水平表达(均P<0.05)，而G2/M期细胞比例比较差异无统计学意义，见图5。

1：si-circFARSA+anti-miR-NC；2：si-circFARSA+anti-miR-671-5p；A：qRT-PCR实验检测miR-671-5p的转染效果；B：MTT法检测细胞活力；C：流式细胞仪检测细胞周期；D：划痕实验与Transwell实验分别检测细胞迁移及侵袭；E：Western blot法测定MMP-2、MMP-9蛋白；与si-circFARSA+anti-miR-NC组比较，*P<0.05图5 抑制miR-671-5p表达可逆转干扰circFARSA表达对AGS细胞增殖、细胞周期、迁移及侵袭的作用Fig.5 Inhibiting the expression of miR-671-5p could reverse the effect of interfering with the expression of circFARSA on the proliferation，cell cycle，migration and invasion of AGS cells

3 讨论

circRNA是非编码RNA领域的研究热点，非编码RNA不参与蛋白质编码，其主要包括miRNA、LncRNA等，其中circRNA属于特殊的非编码RNA，与传统的线性RNA不同，circRNA分子中3′与5′端共价键结合形成环状RNA，其不易被降解且不受RNA外切酶的影响，circRNA分子中富含miRNA结合位点，miRNA可通过与靶基因的3′UTR结合而阻止翻译过程[7-11]。

circFARSA在结直肠癌细胞中高表达，敲低其表达可通过调节miR-330-5p/LASP1轴而限制结直肠癌细胞的生长[12]。circFARSA高表达量与膀胱癌患者复发及转移有关，并可能作为膀胱癌诊断与判断患者预后的潜在生物学标记物[13]。但circFARSA在胃癌中的表达尚未可知。本研究结果显示，胃癌组织中circFARSA的表达水平升高。采用RNA干扰技术下调胃癌细胞中circFARSA的表达后胃癌细胞活力降低，G0/G1期细胞比例升高，S期细胞比例降低。迁移与侵袭是肿瘤细胞远处转移的重要原因之一，且是降低胃癌患者治疗效果的主要原因，MMP-2、MMP-9可促进细胞迁移及侵袭[14-15]。本研究结果显示，干扰circFARSA表达能够抑制胃癌细胞迁移及侵袭，其作用机制与促进细胞外基质沉积有关。

研究表明miR-671-5p在胃癌中呈低表达，circPIP5K1A通过充当miR-671-5p的海绵分子而抑制其表达从而促进胃癌的发展进程[16]。miR-671-5p通过阻断细胞周期而抑制骨肉瘤细胞增殖[17]。circ_0001946作为miR-671-5p的竞争性内源RNA，通过调节miR-671-5p和CDR1而调控胶质母细胞瘤生长及转移[18]。表明miR-671-5p在肿瘤发生与发展过程中可发挥重要调控作用，部分circRNA可靶向结合miR-671-5p而调控其靶基因表达进而发挥作用。

本研究表明，胃癌组织中circFARSA的表达水平升高，miR-671-5p的表达水平降低，二者呈负相关。且进一步证实circFARSA基因序列上含有miR-671-5p的结合位点，并可充当miR-671-5p的海绵分子。在干扰circFARSA表达情况下，miR-671-5p呈高表达，对胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭过程起到抑制作用，同时发挥诱导细胞周期阻滞的作用，circFARSA/miR-671-5p分子轴可参与胃癌生长及发展进程，circFARSA还可能作为胃癌分子治疗的潜在靶点。但circFARSA基因序列上含有多个miRNA的结合位点，本研究仅从中选择一个miRNA进行探究，下一步将继续探寻其他miRNA分子，探究circFARSA是否可通过其他miRNA分子而参与胃癌生长及转移过程，同时还需进行体内动物实验进一步验证。