许嘉豪,陈淑雯,谢珠良,徐铁成,方建斌,朱卓丽,李雄娟△,黄焕森△

1广州医科大学第二临床学院麻醉系(广东广州 510180)；2广州医科大学附属第二医院麻醉科(广东广州 510260)

免疫球蛋白结合蛋白(binding immunoglobulin protein，Bip)广泛表达在细胞内[1-2]，是一种多功能的内质网分子伴侣，作为内质网应激中未折叠蛋白反应的主要调节蛋白，其最重要的功能是依赖ATP结合内质网中新生多肽的疏水性口袋，组织内质网内新生肽聚集，参与蛋白质的正确折叠和转运[3]。目前相关研究发现，乌司他丁在缺血性脑损伤等器官保护中具有重要作用[4]。有研究表明，乌司他丁可降低百草枯中毒模型大鼠海马中Bip的表达量[5]，表明乌司他丁与Bip之间可能存在相互作用。但是目前关于乌司他丁与Bip相互作用关系的研究甚少，且无相关文献报道两者之间分子对接的模拟情况。因此，2019年10月至2020年5月，本研究选用SD大鼠建立大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，采用酶标仪测定大鼠血清、缺血脑组织中乌司他丁和Bip的浓度，通过乌司他丁与Bip分子的体外结合实验，并使用PyMOL软件及分子模拟软件构建乌司他丁与Bip分子对接情况进行分析，探讨乌司他丁与Bip的相互作用，为进一步明确乌司他丁在临床上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠36只，由南方医科大学实验动物中心提供，体重220～250 g。随机分为正常组、实验组。正常组为18只大鼠，经静脉注射乌司他丁20万IU/kg。实验组选取18只大鼠，建立大鼠MCAO模型后随即静脉注射乌司他丁20万IU/kg。乌司他丁为广东天普生化医药股份有限公司生产。

1.2 MCAO模型制备 称量大鼠体重，采用腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg对大鼠进行麻醉，待大鼠完全麻醉后将其腹部朝上固定在手术台上。剃毛器剃掉大鼠颈部毛发并消毒，在颈部正中纵向剪开一个长约25 mm的切口，钝性分离肌肉和组织。之后钝性分离出左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。找到颈总动脉并游离出距离颈内动脉、颈外动脉分叉口约10～15 mm的长度，结扎颈总动脉近心端并穿线备用。结扎颈外动脉。用动脉夹夹住颈内动脉远心端，之后快速在距颈总动脉结扎处3 mm处剪一斜切口。将事先做好的线栓自切口轻轻插入，松开血管夹，插入深度约为18～20 mm,稍遇阻力时停止。此时为缺血开始时间，记录时间，同时经静脉注射乌司他丁20万IU/kg。在斜向切口远心端结扎并固定线栓，将线栓多余的部分缝合在切口之间，最后缝合手术切口。在手术2 h后将线栓拔出。在大鼠麻醉状态下，剪开手术切口缝线，钝性分离组织，用镊子夹取线栓轻轻拔出，再次结扎切口远心端并缝合手术切口。手术后将大鼠放置在温暖、安静、避强光的单独鼠笼中饲养。

1.3 组织样本采集 在给药后0.5、3、24 h，两组大鼠分别各随机选取6只，麻醉后取颈静脉血，血液样品置于肝素化抽血管中，离心后取血清备用。取血后立即处死大鼠，端头取脑，脑组织用生理盐水冲净表面血液和内容物，滤纸吸干后保存备用。

1.4 大鼠血清与脑组织中乌司他丁浓度的测定 参考文献[6]的方法，采用酶标仪测定大鼠血清与脑组织中乌司他丁浓度。取用酶标板，使用PBS按适当比例将各组大鼠缺血侧大脑皮层低温物理快速匀浆，离心后取上清。按一定比例稀释血清、脑组织上清液至180 μL后，加入结晶胰蛋白酶溶液20 μL。每孔终体积为200 μL。混匀后37℃保温5 min，每孔加入BAPNA溶液100 μL，摇匀后37℃孵育5 min，设定波长在405 nm处检测吸光度。根据标准曲线测定样品中乌司他丁浓度。采用三乙醇胺、生理盐水作为空白对照。

1.5 大鼠血清与脑组织Bip浓度的测定 取各组大鼠血清、缺血侧大脑皮质上清液样品，采用酶联免疫吸附法(ELISA)，使用大鼠免疫球蛋白结合蛋白ELISA试剂盒(酶免，China)，按照试剂盒操作说明书操作，测定两组大鼠血清及缺血侧大脑皮质Bip的浓度。

1.6 乌司他丁与Bip的体外结合实验 取乌司他丁标准品(1 000 IU/mL)及Bip标准品(80 pg/mL)各200 μL混合，使得溶液终浓度为：乌司他丁500 IU/mL + Bip 40 pg/mL。将此混合溶液再依次稀释为：乌司他丁250 IU/mL + Bip 20 pg/mL、乌司他丁125 IU/mL+Bip 10 pg/mL、乌司他丁62.5 IU/mL+Bip 5 pg/mL、乌司他丁31.25 IU/mL+Bip 2.5 pg/mL。采用上述酶标仪法、ELISA法分别测定混合液中乌司他丁、Bip浓度，根据测定结果计算两者的结合率。

1.7 计算机分子模拟乌司他丁与Bip的结合 Bip三维结构来自RCSB PDB数据库(PDB ID:5e84)；乌司他丁三维结构来自PubChem(CID:105102)，利用Open Babel GUI对乌司他丁进行格式转换。参照文献[7]的方法，使用分子对接模拟软件(Autodock4.2.6)对Bip进行加氢，计算Gasteiger电荷，对乌司他丁进行操作，完成后进行分子半柔性对接，使用算法为Local Search Parameters，得出对接结果。并利用PyMOL软件构建对接结果。最后，从对接得到的结合构象中取出结合能最小值的构象用于之后的分析。并使用分子模拟软件(DS BIOVIA Discovery Studio 2016 v16.1)，逐一点击Tools/Receptor-Ligand Interacions/View Interaction Ligands，对其进行对接，得出Bip与乌司他丁残基二维相互作用情况。

2 结果

2.1 两组大鼠不同时间点血清、缺血大脑皮质的乌司他丁及Bip浓度变化 在血清样品中，正常组、实验组乌司他丁的浓度均随时间延长而降低，同时也观察到实验组中乌司他丁浓度在0.5 h较正常组升高(P<0.05)。在缺血侧大脑皮质中，正常组、实验组乌司他丁浓度均在3 h较高，24 h后降低(P<0.05)，同时在0.5 h中观察到实验组乌司他丁浓度较正常组降低(P<0.05)。血清中Bip浓度在正常组、实验组各个观察时间点中均没有明显变化(P>0.05)；而在缺血侧大脑皮质中，可观察到实验组缺血侧大脑皮质中Bip浓度在3 h中降低，24 h升高(P<0.05)，同时在3 h中观察到实验组大脑皮质中Bip浓度较正常组低(P<0.05)。见表1。

表1 两组大鼠在0.5、3、24 h中血清、缺血大脑皮质中乌司他丁及Bip浓度变化

2.2 乌司他丁与Bip结合率 在乌司他丁与Bip体外结合实验中，已知混合液中乌司他丁浓度分别为：31.25、62.5、125、250、500 IU/mL，实际测定浓度分别为：(30.90±1.51)、(54.24±4.14)、(74.64±3.79)、(124.44±11.35)、(221.06±22.36)IU/mL。已知混合液中Bip浓度分别为：2.5、5、10、20、40 pg/mL，实际测定浓度分别为：(2.42±0.35)、(3.61±0.21)、(6.09±0.62)、(12.47±1.73)、(18.86±1.09)pg/mL。乌司他丁与Bip结合曲线下移，在一定浓度范围内，计算得出两者结合率为44%～62%。见图1。

图1 乌司他丁与Bip的结合曲线

2.3 计算机分子模拟乌司他丁与Bip的结合情况 乌司他丁与Bip中的残基Asp-94、Thr-38、Thr-37、Gly-36、Ser-40、Thr-171、Ser-64、Ser-146、Pro-173、Phe-93、Phe-176、Val-172、Val-92、Ile-145、Thr-184、Val-66、Tyr-65、Pro-142有范德华力作用，与残基Ala-95、Val-149、Lys-96、Ile-99、Leu-35产生共轭作用。见图2。

3 讨论

本研究参照文献[7]的基础上进行改进。我们的前期实验采用酶标仪法测定乌司他丁浓度，根据线性关系实验结果，其相关系数R2均≥0.98，证明线性关系良好，测定精密度和重复性较好。

本研究结果显示，正常组、实验组血清中乌司他丁浓度随时间延长而降低，符合乌司他丁的药代动力学改变。在0.5 h，实验组血清中乌司他丁的浓度较对照组高，但缺血侧大脑皮质乌司他丁浓度则较正常组降低(约降低50%)，表明实验组在脑缺血模型建立后使得血流动力学改变，导致患侧大脑皮层缺血，血流减少，使得脑组织中乌司他丁浓度降低。在缺血再灌注后，大脑皮层血液灌流得以部分恢复，可观察到脑组织中乌司他丁浓度在3 h升高，24 h降低。有研究指出，缺血中风性大鼠梗死灶脑血流在1 h后下降至对照组的45%[8]。也有研究表明，在局灶性脑缺血发生时，在血流降低最严重的脑组织血流量会锐减至正常脑血流量的20%或完全没有血流，从而形成梗死核心区[9]。缺血半影区由于侧支循环的存在依然能保持一定的血液供给[10]。因此，缺血后即给予乌司他丁静脉注射，可通过血流作用于缺血半影区，对缺血性脑组织可能起到一定的保护作用。

注：A：乌司他丁残基与Bip对接模型图；B：乌司他丁残基与Bip分子对接2D示意图图2 PyMOL软件及分子模拟软件构建乌司他丁、Bip分子对接情况

本研究结果显示，在0.5、3、24 h 3个观察时间点，正常组、实验组大鼠血清Bip的浓度无变化，提示Bip作为一种广泛表达在细胞内的分子伴侣，主要作用于细胞内，较少通过细胞膜及血脑屏障释放至血液循环中。本实验观察到，在缺血再灌注3 h，实验组缺血大脑皮质Bip浓度较0.5 h下降，提示存在Bip的消耗或乌司他丁形成结合物，导致ELISA法无法测定结合状态的Bip浓度。随后观察到Bip浓度在24 h升高，一方面可能是由于乌司他丁逐步代谢，与Bip解离，使游离状态的Bip增多，另一方面可能是由于缺血缺氧后应激反应启动基因转录和翻译，使得缺血大脑皮质Bip表达升高。有研究表明，缺血缺氧可引发内质网应激，细胞调亡与Bip等内质网应激分子表达量的改变有关[11-13]。因此，Bip的含量改变与脑缺血再灌注损伤有关。

本研究分子对接软件模拟结果也显示，乌司他丁与Bip中的残基可形成范德华力及共轭作用，但乌司他丁未能与周围残基形成氢键，因此无法形成稳定的复合物。有文献指出，乌司他丁可提高脑缺血再灌注模型大鼠脑皮质中Bip 的表达量[14]，提示两者可能存在某种直接或间接作用。同时在实验中观察到乌司他丁与Bip的结合率约为50%，表明两者确实存在结合作用。

综上所述，在缺血大脑皮质中乌司他丁可与Bip形成不稳定复合物，其可能通过影响Bip的表达而在脑缺血再灌注中发挥着一定作用。