白惠玲 樊爱芳 刘勤 张书 王芃萱

1甘肃省人民医院眼科，兰州 730000；2甘肃中医药大学第一临床医学院，兰州 730000

葡萄膜炎病因复杂，是全球主要的致盲眼病，前葡萄膜炎是葡萄膜炎常见的类型。大多数观点认为葡萄膜炎是由各种原因引起自身免疫功能紊乱导致的机体对自身抗原的免疫应答所致，其发病机制主要与CD4+T淋巴细胞活性有关，尤其是辅助性T(T helper，Th)细胞及其分泌的细胞因子所介导的免疫反应在葡萄膜炎的发生和发展过程中起重要作用[1]。既往已有研究表明，Th细胞相关因子γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)和白细胞介素(interleukin，IL)-17作为促炎因子参与葡萄膜炎的发病[2-3]；IL-4、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和IL-35作为抑炎因子参与葡萄膜炎的发病[4-6]；而IL-22则在葡萄膜炎的发病中发挥促炎及抗炎的复杂作用[7-8]。IL-9是近年被发现的新型细胞因子，主要由Th9细胞分泌，目前已受到越来越多研究人员的关注。多种自身免疫性疾病及相关动物模型研究发现，IL-9在炎性疾病过程中发挥促炎和抗炎的双重作用[9]，但关于IL-9是否参与急性前葡萄膜炎发病的临床报道较少。本研究拟通过分析急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9、IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-35和IL-22的表达水平，探讨IL-9与其他Th细胞相关因子在急性前葡萄膜炎发病中的作用及其相互关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用横断面研究方法，选取2018年5月至2019年5月在甘肃省人民医院就诊的急性前葡萄膜炎患者36例36眼，其中男20例，女16例；平均年龄(36.61±14.23)岁；等效球镜度数为(-0.90±1.05)D。急性前葡萄膜炎诊断参考《2016年我国急性前葡萄膜炎临床诊疗专家共识》[10]：(1)裂隙灯显微镜检查前房内可见前房闪辉和浮游的炎性细胞，为诊断前葡萄膜炎的必要条件；(2)急性发作且持续时间少于3个月；(3)可见角膜后沉着物(keratic precipitates，KP)，呈尘状或羊脂状，中等大小；(4)患者有眼痛、畏光、流泪、视物模糊等症状。纳入标准：单眼初发病例，符合急性前葡萄膜炎的诊断标准。排除标准：(1)全葡萄膜炎或中间葡萄膜炎伴发的前葡萄膜炎患者；(2)合并其他眼部疾病或有反复发作史者；(3)近1个月内服用抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、免疫调节剂等者；(4)合并感染性疾病者；(5)合并强直性脊柱炎、炎性反应性肠道疾病等全身疾病者。同期纳入体检正常者40人40眼作为健康对照组，其中男21人，女19人；平均年龄(42.43±17.25)岁；等效球镜度数为(-0.95±1.00)D。纳入标准：无眼病及全身疾病的健康人群。排除标准：近1个月内服用抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、免疫调节剂等者。2个组性别构成比、年龄、等效球镜度数比较差异均无统计学意义(χ2=0.071，P>0.05；t=1.591，P>0.05；t=0.213，P>0.05)。本研究过程遵循《赫尔辛基宣言》，研究方案经甘肃省人民医院伦理委员会批准(批文号：2019-204)，所有受检者均了解本研究目的及方法，并自愿签署知情同意书。研究期间所有受检者的个人信息均保密。

1.2 方法

1.2.1病情严重程度评价方法 参照文献[11] 对葡萄膜炎严重程度进行分级：(1)轻度 睫状充血，KP+～++，前房炎性细胞-～++，前房闪辉-～++；(2)中度 睫状充血，KP++～+++，前房炎性细胞++～+++，前房闪辉++～+++；(3)重度 混合充血，KP+++～++++，前房炎性细胞+++～++++，前房闪辉+++～++++，前房纤维素性渗出，前房积脓。

1.2.2受检者血清样本收集 收集受检者清晨空腹肘静脉血各5 ml，非抗凝状态于室温下自然凝固后置于37 ℃温育箱孵育1 h。离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)离心半径17 cm，3 000 r/min离心15 min。收集血清于EP管(苏州Axygen公司)中，封口，标记，-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3酶联免疫吸附测定法测定受检者血清IL-9及其他Th细胞相关因子质量浓度 将血清在室温下自然溶解，细胞因子检测试剂盒在室温中放置30 min以上。采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司)以双抗体夹心法测定受检者血清中IL-9、IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-35、IL-22质量浓度。按照试剂说明书完成实验，根据标准品通过ELISA Calc软件绘制标准曲线，计算样品质量浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件进行统计分析。计量资料数据采用Shapiro-Wilk法进行正态分布检验，证实年龄和等效球镜度数满足正态分布，以mean±SD表示，血清中细胞因子数据资料呈偏态分布，以M(Q1，Q3)表示；性别分布为计数资料，以频数表示。急性前葡萄膜炎组与健康对照组间年龄和等效球镜度数差异比较采用独立样本t检验，患者性别分布差异比较采用χ2检验。2个组受检者血清各细胞因子质量浓度差异比较采用Mann-WhitneyU检验；不同程度前葡萄膜炎组患者血清中IL-9质量浓度总体差异比较采用Kruskal-WallisH检验，组间两两比较采用Mann-WhitneyU检验；血清中IL-9质量浓度与其他Th细胞因子质量浓度间的关系评估采用Spearman秩相关分析，并对相关系数进行假设检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2个组间IL-9及其他Th细胞相关因子质量浓度比较

与健康对照组比较，急性前葡萄膜炎组患者血清中IL-9、IFN-γ、IL-4、TGF-β1、IL-35、IL-22质量浓度均明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；急性前葡萄膜炎组与健康对照组间血清中IL-17质量浓度比较差异无统计学意义(U=704.500，P>0.05)(表1)。

表1 2个组受检者IL-9及其他Th细胞相关因子质量浓度比较[M(Q1,Q3),ng/L〛Table 1 Comparison of IL-9 and other Th cell-related cytokines concentrations between the acute anterior uveitis group and healthy control group [M(Q1,Q3),ng/L〛组别眼数IL-9IFN-γIL-4IL-17急性前葡萄膜炎组3671.68(54.01,104.46)637.81(307.38,845.06)761.50(657.19,980.22)55.71(34.47,73.88)健康对照组4051.17(44.45,60.32)310.33(170.92,571.42)469.86(380.75,806.05)57.51(48.23,68.40)U值1 043.500981.5001 075.500704.500P值0.0010.007<0.010.872组别眼数TGF-β1IL-35IL-22急性前葡萄膜炎组36822.48(623.37,1 202.09)77.29(48.03,106.95)146.88(124.96,211.09)健康对照组40695.95(507.03,826.20)62.06(44.36,79.70)103.93(78.13,134.04)U值1 030.000970.5001 080.000P值0.0010.009<0.01 注:(Mann-Whitney U检验) IL:白细胞介素;Th:辅助性T;IFN-γ:γ干扰素;TGF:转化生长因子 Note:(Mann-Whitney U test) IL:interleukin;Th:T helper;IFN-γ:interferon-γ;TGF:transforming growth factor

2.2 急性前葡萄膜炎不同严重程度组患者血清中IL-9质量浓度比较

疾病严重程度分级结果显示，急性前葡萄膜炎患者轻度组、中度组和重度组IL-9质量浓度分别为57.24(47.47，65.10)、71.68(67.55，78.91)和114.01(74.78，139.30)ng/L，总体比较差异有统计学意义(Z=8.766，P=0.012)，其中轻度组和中度组受检者血清中IL-9质量浓度均明显低于重度组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.3 急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9质量浓度与其他Th细胞相关因子质量浓度的相关性

急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9质量浓度与IL-17、TGF-β1、IL-35质量浓度变化均呈正相关(rs=0.449，P=0.006；rs=0.517，P=0.001；rs=0.400，P=0.016)，与IFN-γ、IL-4、IL-22无明显相关性(rs=0.293，P=0.078；rs=0.286，P=0.091；rs=0.316，P=0.06)(图1)。

图1 急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9与IL-17、TGF-β1、IL-35质量浓度相关性分析(Spearman秩相关分析，n=36) A：IL-9质量浓度与IL-17质量浓度呈正相关(rs=0.449，P=0.006) B：IL-9质量浓度与TGF-β1质量浓度呈正相关(rs=0.517，P=0.001) C：IL-9质量浓度与IL-35质量浓度呈正相关(rs=0.400，P=0.016) IL：白细胞介素；TGF：转化生长因子Figure 1 Correlation analysis between concentration of serum IL-9 and IL-17,TGF-β1,IL-35(Spearman rank correlation analysis,n=36) A:Serum IL-9 concentration was positively correlated with IL-17 concentration (rs=0.449,P=0.006) B:Serum IL-9 concentration was positively correlated with TGF-β1 concentration (rs=0.517,P=0.001) C:Serum IL-9 concentration was positively correlated with IL-35 concentration (rs=0.400,P=0.016) IL:interleukin；TGF:transforming growth factor

3 讨论

葡萄膜炎是临床常见的眼部炎性疾病，可对眼组织造成不可逆损害。自身免疫性葡萄膜炎主要由CD4+T细胞介导。初始CD4+T细胞识别特异性抗原后活化，进一步分化为不同T细胞亚群，主要包括Th1、Th2、Th17、Tfh、Th9、Th22、Treg等。不同CD4+T细胞亚群表达不同的特异性转录因子和细胞因子，参与不同类型的免疫应答或调节免疫[12]。

Th1细胞被认为是葡萄膜炎发生过程中起关键作用的细胞群，其标志性细胞因子为IFN-γ，主要介导细胞免疫应答并参与自身免疫性疾病的组织损伤，与器官特异性自身免疫性疾病、慢性迁延性炎症等有关。本研究中IFN-γ在急性前葡萄膜炎组患者血清中的质量浓度较健康对照组明显升高，表现出其致炎的作用机制，与既往研究结果一致[2]。Th2细胞分泌的IL-4抑制Th1细胞表达IFN-γ，Treg细胞分泌的TGF-β1、IL-10、IL-35抑制各T细胞亚群的应答，因此Th2细胞和Treg细胞可在一些Th1细胞介导的自身免疫性疾病中发挥抑制效应，并在疾病的活动期呈低表达状态，其高水平表达与疾病缓解期显著相关[4-6]。本研究发现急性前葡萄膜炎患者血清中IL-4、TGF-β1、IL-35质量浓度较健康对照明显升高，可能与患者病程处于缓解期有关。既往研究报道，Th17细胞能分泌多种致炎因子，在葡萄膜炎的发病过程中发挥促炎作用，IL-17是Th17细胞免疫效应的标志性细胞因子[3]。本研究结果显示，急性前葡萄膜炎患者血清中IL-17质量浓度并未升高，而动物实验表明实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠血清中IL-17的表达呈现双峰样曲线[13]，因此本研究中患者血清中IL-17质量浓度并未升高的原因可能与部分患者处于疾病中间病程有关。Li等[8]研究显示，葡萄膜炎患者外周血单核细胞中IL-22呈高表达，与本研究急性前葡萄膜炎患者血清中IL-22质量浓度高于健康对照的研究结果一致。

Th9细胞是近年来发现的CD4+Th细胞亚群，其在炎症性疾病中的作用受到越来越多的关注，成为自身免疫性疾病研究领域的热点。初始CD4+T细胞受抗原刺激后在TGF-β1和IL-4的作用下向Th9细胞分化[14]，其特征在于高水平分泌IL-9。除Th9细胞外，其他多种细胞也可产生IL-9，包括Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞、肥大细胞和自然杀伤细胞。IL-9在类风湿性关节炎、银屑病、特应性皮炎、结肠炎、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、系统性硬化症、变态反应性炎症、1型糖尿病和多发性硬化症等自身免疫性疾病的病理生理过程中起关键作用[15-27]。然而，IL-9在葡萄膜炎中的作用研究报道较少。Nouri-Vaskeh等[28]对32例白塞病患者与56例健康对照者血清中IL-9水平进行比较发现，二者无显著差异，并且血清中IL-9水平与白塞病的临床特征和疾病严重程度无明显相关性。Peng等[29]研究表明，IL-9参与小柳原田病的发病机制，并且IL-9还可以通过增加IL-17的分泌来增强炎症反应。本研究结果显示，急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9质量浓度升高，且与疾病的严重程度呈正相关，提示IL-9可能促进急性前葡萄膜炎的炎症过程，是急性前葡萄膜炎病程中重要的细胞因子。此外，本研究结果显示急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9与Th17细胞分泌的IL-17、Treg细胞分泌的TGF-β1和IL-35质量浓度均呈正相关，与血清中Th1细胞分泌的IFN-γ、Th2细胞分泌的IL-4、Th22细胞分泌的IL-22质量浓度均无明显相关性，提示IL-9的作用与Th17、Treg细胞密切相关。IL-9可与Th17细胞分泌的促炎因子发挥协同作用，也可促进Treg细胞的免疫抑制活性，导致效应T细胞减少，保护机体不受外界危险信号的影响[30-31]。

综上所述，IL-9在急性前葡萄膜炎的病程中可能具有促进免疫炎症反应的作用，其与Th1、Th2、Th17、Th22、Treg细胞密切相关，它们之间共同构成复杂的网络关系来发挥免疫效应。因此，抗IL-9疗法可能减轻患者自身免疫性疾病的严重程度，对于急性前葡萄膜炎患者，IL-9的靶向治疗可能成为未来的研究方向，但由于上述细胞之间相互调节的复杂性，在实际治疗过程中不能只考虑某种单一因素，而需要多种因素相结合来达到治疗的目的。本研究样本量较小，对于这些细胞及其因子的作用机制及其之间的相关关系仍需要进一步收集大样本数据进行深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突