尚丛珊，孟婷婷，侯亚妮，李元，刘利兵

西安培华学院医学院，陕西西安710125

病原体感染是引起儿童急性腹泻和重症腹泻的主要原因，如轮状病毒（rotavirus，RV）［1］、诺如病毒（Norovirus，NoV）［2］、人星状病毒（human astrovirus，HAstV）［3］、札如病毒（Sap virus，SaV）［4］、腺病毒（adenoviruses，AdV）［5］等，其中 RV 是引起成人及儿童腹泻的常见病毒。RV 是一种RNA 病毒，基因组为双链RNA，由11 段基因组成，分别编码6 种结构蛋白（VP1 ~ 4、VP6 和 VP7）和 6 种非结构蛋白（NSP1 ~ 6）［6-7］。根据 VP6 抗原蛋白结构不同，可分为 A~J 共 9 个群，只有 A、B 和 C 群 RV 可感染人类，且在人和动物中均有发现，A 群RV 一般不感染成人，但其是感染婴幼儿的主要病原体［8-9］，目前尚无特效药。

RV 诊断常用的检测方法主要有电镜观察、ELISA 法、胶体金法、核酸杂交法及实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法等［10］。微滴数字 PCR（RT-ddPCR）法不依赖标准曲线，属于终点检测，不受扩增循环阈值的影响，定量结果更精确，对PCR 抑制剂更耐受，在改善定量分析准确性和变异性上有较大优势［11-12］。目前PCR 检测RV 体系主要以VP6、VP7 及NSP3 基因作为毒株的靶标，但在RT-ddPCR 检测体系的应用鲜见报道。非结构蛋白NSP5 为重要的胞质磷蛋白，RV 感染细胞后，NSP5 在胞质内表达并参与形成病毒池结构，调控RV 的复制和包装，NSP5 基因相对其他基因段具有高度保守的氨基酸序列［13-14］。因此，本研究建立一种基于NSP5 基因A组RV 的RT-ddPCR 检测方法，以期用于RV 的临床快速检测。

1 材料与方法

1.1 样本 临床样本来源于西安市儿童医院2018—2019 年门诊病例中5 岁以下腹泻患儿的粪便标本，共150 份（胶体金检测RV 阳性98 份，阴性52 份，阳性率为65.3%）。

1.2 细胞、质粒及病毒 MA104 细胞及质粒pEGFP-N2购自宝生物工程（大连）有限公司；A 组RV 由西安交通大学医学院微生物学实验室从阳性粪便样本中分离、鉴定和保存，NoV（基因型 GⅠ）、Adv（基因型 F4l 型）、HAstV（HAstV-1 型）及 SaV（GⅠ基因型）由该实验室保存。……