吴清胜，吴相英，姚春萍，李媛媛，

1.国药中生生物技术研究院有限公司，北京101111；2.北京生物制品研究所有限责任公司，北京100176

杆状病毒表达载体系统（baculovirus expressionvector system，BEVS）是以杆状病毒为外源基因载体，以昆虫细胞为受体的一种真核表达系统，具有效率高、容量大、表达产物能进行折叠和修饰等特点［1-3］。自20 世纪80 年代建立以来，BEVS 已经发展为成熟的生物制品生产平台，有多种产品获批，包括兽用疫苗、人用疫苗及治疗产品［4-8］。杆状病毒不会刺激哺乳动物产生强烈的免疫应答，也不会对其造成功能性损伤，这些特性使其成为一种极具应用前景的基因治疗载体［9］。无论是疫苗研发，还是基因治疗［10-11］，杆状病毒滴度的快速、准确检测均至关重要，荧光定量PCR（qPCR）法具有操作简单、灵敏度高、耗时短等优点［12-14］。本文通过设计H5 基因的引物及探针，以Bacmid-H5 重组质粒为标准模板，对PCR 的退火温度及引物浓度进行优化，建立了检测H5 基因拷贝数的qPCR 法，并对该方法的专属性、重复性进行验证，确定线性范围及检测限，并应用该方法和免疫荧光法［15］对H5 杆状病毒连续传代4 次及连续培养0 ～6 d 的样品进行检测。

1 材料与方法

1.1 菌株、病毒及细胞 含重组rBacmid-H5 的E.coli菌株DH10Bac 由国药中生研究院有限责任公司第七研究室制备，重组H5 杆状病毒、重组H1 杆状病毒、未重组杆状病毒均由该室制备；Sf9 昆虫细胞购自ATCC。

1.2 主要试剂及仪器 SFX-Insect 培养基购自美国GE 公司；EASY Dilution（for Real Time PCR）、Probe qPCR Mix 购自日本TaKaRa 公司；无内毒素质粒大提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；LB Brothready to use 购自生工生物工程（上海）股份有限公司；……