邬琪焕，练祥，柯婷婷，梁云，张增增，胡宇涛，孙斌辉

抗病毒治疗是符合治疗指征的慢性乙型肝炎（CHB）患者首要的治疗措施[1]，核苷（酸）类药物（NAs）为主要药物，包括一线药物恩替卡韦（ETV）、富马酸替诺福韦酯（TDF）和富马酸丙酚替诺福韦（TAF），非一线药物包括拉米夫定（LAM）、替比夫定（LdT）和阿德福韦酯（ADV）。NAs 相关的耐药突变均位于乙型肝炎病毒（HBV）基因组逆转录酶区（RT区）。研究表明，未经药物治疗的CHB患者存在不同比例的原发耐药突变，而在药物压力选择之下，HBV 的耐药更加容易发生，因此研究当地的耐药突变情况具有重要意义[2-3]。本文拟分析249 例CHB患者HBV-RT区基因突变情况，探讨突变位点的异质性以及临床意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料与方法 收集2014 年2 月至2019 年7 月浙江省象山县第一人民医院医疗健康集团收治的CHB 患者249例，均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019 版）》中CHB 诊断标准[1]，经NAs治疗后仍HBV DNA 阳性，或出现病毒学突破。收集患者的HBV-RT 耐药突变位点信息、用药情况、肝功能、HBV血清学标志物、HBVDNA、临床诊断、出现耐药后的药物调整情况及HBVDNA转阴时间等信息。根据HBV-RT 区是否存在耐药突变，分为非耐药组和耐药组。研究获得医院医学伦理委员会批准，被研究者的临床资料均经过查阅病历和电话随访证实。

1.2 实验室指标 包括肝功能，HBV血清学标志物及HBV DNA 等。血清肝功能丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测采用Olympus AU2700全自动化分析仪检测。HBV血清学标志物采用美国雅培Abbott AxSYM System 全自动化学发光分析仪。外周血清HBV DNA 检测采用荧光定量PCR 法（检测下限20 IU/ml）。

1.3 HBV-RT 区测序 采用ABI 3130型基因测序仪检测HBV-RT 区基因（长度450 bp），涵盖了临床应用的所有NAs（包括LAM、LdT、ADV、ETV、TDF 及TAF）的常见耐药位点，检测的位点包括rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtM204I/V、rtV207I/L/G、rtS213T、rtA181V/T、rtV214A、rt Q215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T、rtT184A/G/S/I/L/F、rtS202G/I及rtM250V/L/I。由分子生物学实验室同一位检验人员完成。

1.4 统计方法 数据采用SPSS19.0 软件处理，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，采用t 检验；非正态分布的计量资料以M（P25～P75）表示，采用非参数检验；计数资料采用2检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药组与非耐药组临床特征分析两组性别比、ALT 及HBV DNA 水平差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。两组年龄、治疗后HBV DNA转阴时间差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 耐药组与非耐药组临床特征分析

2.2 HBV-RT 区耐药位点突变类型108 例HBV-RT 区耐药中，单位点突变占37.96%（41/108），以rt M204I 位点及rtA181V 位点常见，其中男31 例，女10例；二联位点突变占33.33%（36/108），以rt L180M + rt M204V、rt A181V+rt N236T常见，其中男31 例，女5 例；多位点突变占28.70%（31/108），以rt L180M+rt M204V突变基础上rtS202/rtV173 发生突变常见，其中男22 例，女9 例。3 组性别构成比差异无统计学意义（2=2.39，P＞0.05）。

2.3 HBV-RT区各耐药位点突变频率HBV-RT 区耐药位点突变发生频率不同，突变最多的位点为rtM204 位点（77/216），其次为rtL180 位点（52/216），rtI169 位点突变最少发生（1/216），见表2及封二彩图3。

表2 HBV-RT 区各耐药位点突变频率

2.4 不同药物应用下的耐药情况及相关耐药位点 108 例耐药组患者所覆盖的NAs 相关耐药通路161 例次，其中含L 型核苷耐药通路（rt M204 位点突变）77 例次（47.83%），含无环磷酸盐耐药通路（rt 236 位点突变）15 例次（9.32%），含共享（公共）耐药通路（rt A181 位点突变）32 例次（19.86%），含双重耐药通路（rt A181T/V+rt N236T 位点突变）10 例次（6.21%），含ETV 初治耐药通路（即rt L180M+rtM204V 再加上rtI169、rtT184、rtS202 或rtM250 任意一个或多个位点突变）22 例次（13.66%），多药耐药通路（180L/M+181A/T+204M/V、180M+181G+202G+204V、180M+181V+204V、181A/T+204M/I 及181T/V+236N/T+250M/L）5 例次（3.11%）。见表3。

表3 249 例患者发生耐药突变的情况

3 讨论

HBV 是一种部分闭合的环状双链DNA 病毒，具有高变异性[4]，由于基因组较小，在病毒逆转录过程中又不具备校正功能；加上NAs 仅能大幅度降低血清中的HBV DNA 的含量，而减少HBsAg和HBV cccDNA 的作用不明显[5]，使得慢性HBV感染患者需要长期应用NAs。NAs 抗病毒治疗过程中极易产生耐药，CHB 患者使用NAs 抗病毒治疗1 年以上者，耐药比例每年增加达14%～20%[6]。因此在NAs 治疗过程中，许多患者的HBV准种池内可能出现不同比例的耐药突变病毒准种，进而导致病毒学突破或临床耐药，很大程度上降低了抗病毒疗效，促进疾病进一步发展为终末期肝病[7]。

本研究结果表明，出现病毒学突破或临床耐药患者中，耐药组患者的平均年龄及优化治疗后DNA 转阴时间均高于非耐药组。在长时间的药物压力或/和宿主免疫压力下，人体内HBV准种池中易产生各种形式的准种突变株。因此，年龄较大的患者较早或较高频率出现病毒学突破或临床耐药，及时进行耐药基因检测显得十分关键，能及时发现相关耐药，调整后续抗病毒治疗方案。目前LdT常见相关变异位点为rt M204I，LAM 相关突变主要包括rt V173L、rt L180M 和rt 204I/V 等，ADV 耐药变异集中于rt A181V、rt N236T；ETV 目前发现的耐药突变大多发生于LAM 耐药的患者[8]。本研究108 例耐药组患者所覆盖的NAs 相关耐药通路中，含L 型核苷耐药通路最常见，但是含共享（公共）耐药通路（rt A181 位点突变）与含ETV 初治耐药通路分别位列第2、3 位。共享（公共）耐药通路可导致L 型核苷类药物和ADV 耐药，并降低TDF 的敏感性[9]，而ETV 与TDF 均为目前广泛使用的一线抗病毒药物，因此，对于病毒学应答不佳的经治患者，应选择无交叉耐药的优化用药方案或联合用药方案。

HBV 各耐药位点的突变发生频率不同，变异最多的位点为rtM204，其次为rtL180，rtI169 位点突变最少发生，其中仅rtV173位点上，女性的突变率高于男性，差异存在统计学意义（P=0.014）。本研究中的主要变异位点类型基本是各相关药物的常见耐药变异位点，体现了一致性。

研究表明，LAM第1、2、3 及4 年耐药变异发生率分别为14%、38%、49%和66%，LdT 略优于LAM，但总体耐药率仍很高；ADV第1、2、3、5 年耐药率分别为0、1.6%、3.1%和29%，ETV 5 年累计 耐药率1.2%，TDF耐药仅有极少数报道[8]。本研究耐药组中，LdT、LAM 耐药位点检出率较高，容易出现耐药，几乎任何用药情况都会出现，相对而言ADV及ETV的耐药位点检出率较低，不同药物耐药率的高低与大数据相差甚远，可能与数据经过特定条件入组有关，但总体耐药率高低顺序符合相关研究的趋势。同时LAM、LdT的应用仍占较大比例，可能与早期较多选择非一线药物有关，可尽早调整为高耐药屏障的以下一线抗病毒药物[10]。

综上所述，临床医生对需要抗病毒治疗的CHB患者首选ETV、TDF及TAF等一线用药，如出现病毒学应答不佳时及时给予HBV耐药检测，以根据后续结果调整用药，从而减少耐药突变的发生。