李瑞明 杨燕 曾宪煌 孟忠吉

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌的重要原因之一[1-2]。核苷(酸)类似物[nucleos(t)ide analogues, NAs]广泛应用于乙型肝炎的治疗，大多数患者需要长期治疗甚至终身治疗，但是随着治疗时间的延长，产生HBV耐药性突变的风险会随之增加[3-5]。本研究旨在建立HBV临床分离株的体外复制稳定表达系统，研究其特征及其耐药机制，并针对不同患者体外筛选有效的抗HBV药物。

材料与方法

一、 实验材料

乙肝病毒全长基因组PCR扩增产物由本研究所从乙型肝炎患者血清中克隆扩增获得，在之前的文章中已经报道[6]，参照Gunther等[7]设计引物及Durantel等[8]的HBV全长PCR参数，扩增出HBV全长基因组DNA。

质粒pcDNA3.0(-)-EGFP-ΔCMV由本研究所构建并保存，通过反向PCR删除了CMV启动子，并在转录终止序列BGH-pA的下游插入完整的绿色荧光蛋白(EGFP)表达框(图1)；大肠杆菌DH5a感受态购自北京天根生化科技有限公司。

PCR扩增仪(美国Bio-Rad)，酶标仪(德国Eppendorf)，定量PCR仪(美国ABI stepone plus)，Chamber Slides(美国Thermo Fisher Scientific)；限制性内切酶T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司；高保真DNA聚合酶、DIG DNA Labeling and Detection Kit购自罗氏公司；DMEM培养基、脂质体Lipofectamine 2000、胎牛血清、G418(50 mg/mL)购自Invitrogen公司； DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；HBsAg和HBeAg EILISA检测试剂盒购自科美公司；HBcAg和HBsAg抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

人肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15细胞系均为本室保存。

二、研究方法

(一) 引物设计 使用Vector Nti设计所需要引物，并由擎科生物公司合成。扩增0.2拷贝HBV 引物序列：pcDNA-232-HBV-2795-NotI-U tacggg-ccagatatacgcggccgcggatcctgcgcgggacgt，pcDNA-1255-HBV-169-SacI-D aagccatagagcccaccgagctcagatctcgaa-tagaaggaaaaaagtc。扩增1.0拷贝HBV引物序列：HBV-X15-BamHI-U cgcggatcctgcgcgggacgtcctttgtc-ta，HBV-X15-BamHI-D cgcggatccagttggcagcacaccc-tagcagc。

(二) 0.2拷贝及1.0拷贝HBV基因组的扩增 取2 μg HBV全长基因组PCR产物经SapI 37℃酶切4 h，纯化后取100 ng回收产物T4 DNA连接酶16℃过夜连接得到环状HBV全长基因组。……