魏冬梅，邹 娟，梅 玲*

1.四川大学华西第二医院出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室(四川 成都 610041)

2.四川大学华西第二医院妇科(四川 成都 610041)

3.四川大学华西第二医院病理科(四川 成都 610041)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)占所有卵巢恶性肿瘤的90%以上。肿瘤减灭术联合6～8个疗程以铂类为基础的诱导化疗是晚期EOC的标准一线治疗。尽管75%的晚期病例在一线治疗结束后可以获得完全临床缓解(clinical complete remission，CCR)[1]，但70%～80%患者在5年内复发[2]，仅20%～40%的患者生存期可以超过5年[3]。临床上，诊断EOC复发后，首先启用的治疗方案仍是化疗，但如何选药则取决于肿瘤对铂类药物的敏感性。小于15%的耐药病例对复发后的铂类化疗有反应，而即使是对后续化疗反应良好的铂类敏感病例，随着化疗的进行，敏感病例最终会转变为耐药病例，使妇科肿瘤医生陷入困境，因此EOC对铂类药物产生耐药的机制以及如何降低卵巢癌细胞对铂类药物的耐药性成为EOC治疗中的关键问题。

目前，对顺铂(DDP)耐药机制的解释主要有以下两种:一是减少细胞对顺铂的摄入或增加细胞对顺铂的排泄；二是增强对顺铂造成的DNA损伤的修复功能。近年研究发现线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)在肿瘤的发生、信号传导和凋亡方面具有重要作用[4]。mtDNA突变、mtDNA整合入核基因组以及线粒体结构和功能的异常与多种肿瘤的发生有关[5]。在这些mtDNA异常和损伤中，活性氧(reactive oxygen species，ROS)起着重要作用，研究发现[6]ROS对肿瘤细胞的影响是一柄双刃剑，它既可以促进肿瘤细胞的增殖，也可以促进肿瘤细胞的凋亡，具体作用取决于细胞内ROS水平和细胞本身对ROS的敏感程度。

解偶联蛋白(uncoupling proteins，UCPs)是位于线粒体内膜上的转运蛋白，为线粒体膜间隙的部分质子提供了ATP合成酶以外的通道，使其返回到线粒体基质中，从而使得氧化作用与磷酸化过程解偶联。同时，因线粒体内膜两侧的质子动势降低，线粒体呼吸链中的“电子漏”减少，ROS生成也减少。线粒体解偶联蛋白家族中共有5个成员(UCP1－5)，其中UCP2分布最为广泛。研究发现[7－8]UCP2在结肠癌、乳腺癌等多种癌组织中呈高水平表达，且与肿瘤分化程度相关。Pozza等[9]研究提示UCP2的高表达或者外源性的解偶联剂可以降低化疗诱发的细胞凋亡，增加肿瘤细胞对化疗药物(吉西他滨)的耐受性。相反，Pons等[10]在一个小样本的免疫组织化学研究中发现，对DDP联合紫杉醇耐药的浆液性卵巢癌组织中UCP2的表达水平较敏感组低。

笔者推测，调节ROS生成的UCP2与肿瘤及肿瘤耐药性有密切关系，但迄今为止，尚无研究详细报道UCP2与EOC的耐药性间的具体联系。本研究使用UCP2抑制剂京尼平抑制UCP2功能，使用解偶联剂羰基－氰－对－三氟甲氧基苯腙(FCCP)模拟UCP2的解偶联作用，研究UCP2对人卵巢癌细胞DDP耐药性的影响是否通过调节细胞内ROS水平实现。

1 材料与方法

1.1 细胞培养使用四川大学华西第二医院/西部妇幼医学研究院公共实验室存储的人卵巢腺癌细胞株和其DDP耐药亚株COC1和COC1/DDP细胞，行细胞复苏和传代，COC1细胞和COC1/DDP细胞培养于含10%胎牛血清的PRIM－1640培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞呈悬浮生长，每天半量更换培养液，取对数生长期细胞进行实验。对于COC1/DDP细胞，在细胞复苏后传至3代，若要继续培养传代，需加入DDP，以保持其耐药性。DDP浓度从0.1mg/L逐渐增加，每3d增加0.1mg/L，最终细胞持续良好地生长在0.4mg/L的DDP中。

1.2 COC1/DDP耐药指数鉴定对COC1细胞，DDP设置9个浓度梯度:0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80、1.20和1.60 mg/L。对COC1/DDP细胞，DDP同样设置9个浓度梯度:0.20、0.25、0.40、0.50、0.80、1.00、1.60、2.00和3.20 mg/L。培养细胞处于对数生长期，收集细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液，轻轻吹打细胞成单细胞悬液，调整细胞密度为1×104个/mL，接种于96孔板，200μL/孔。按照预先设定的浓度梯度，加入DDP，每一浓度设4个复孔，同时设置空白调零孔和对照孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h。每孔加10μL WST－1溶液，使用酶标仪测定波长450 nm处吸光值X，计算4个复孔的平均值，抑制率＝，根据药物浓度和各个浓度的抑制率作出细胞生长抑制曲线，根据曲线求得DDP对细胞的50%抑制浓度，即IC50。重复实验3次，分别计算3次实验所得的COC1细胞和COC1/DDP细胞的IC50的平均值。COC1/DDP耐药指数＝COC1/DDP的IC50÷COC1的IC50。

1.3 实验分组培养COC1/DDP细胞处于对数生长期，收集细胞，分为空白组:细胞中不添加任何药物；FCCP组:细胞中加入FCCP(美国Santa Cruz公司)，终浓度为0.4μmol/L(该浓度由预实验测试确定，对COC1/DDP细胞的生长影响＜20%)；京尼平组:细胞中加入京尼平(成都锦泰和医药化学技术有限公司)，终浓度为2 mg/L(该浓度由预实验测试确定，对COC1/DDP细胞的生长影响＜20%)；DDP组:细胞中加入DDP(云南个旧生物药业有限公司)，分0.4、1和2μg/mL共3个浓度梯度；DDP联合FCCP组:细胞中加入DDP和0.4μmol/L的FCCP，DDP浓度分0.4、1.0和2.0μg/mL共3个浓度梯度；DDP联合京尼平组:细胞中加入DDP和2.0 mg/L的京尼平，DDP浓度仍设0.4、1.0和2.0μg/mL共3个浓度梯度。细胞接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h。

1.4 京尼平、FCCP联合DDP诱导COC1/DDP细胞凋亡分别收集各组细胞于12支离心管内，加入PBS液洗涤2次，使用Annexin V－FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，按操作流程使用流式细胞仪检测(激发波长488 nm，发射波长525nm)，测定1×105个细胞，计算各组细胞的凋亡细胞所占百分率。实验重复3次。

1.5 ROS产量测定分别收集各组细胞于12支离心管内，使用活性氧检测试剂盒(普利莱基因技术有限公司)，按照操作流程使用流式细胞仪在激发波长488nm，发射波长525nm条件下测定1×105个细胞的平均荧光强度，用各组细胞的平均荧光强度值除以空白组的平均荧光强度，即为各组ROS产量的相对值，反应各组细胞内ROS含量。重复实验3次。

1.6 统计学处理采用SPSS 19.0统计学软件进行数据录入，独立样本t检验统计各组样本之间均数差异，t检验比较不同药物组的COC1/DDP细胞凋亡率的差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 京尼平、FCCP对COC1/DDP细胞耐药性的影响在没有DDP的情况下，FCCP使COC1/DDP细胞的凋亡率由10.94%下降至7.23%(P＜0.001)；京尼平可明显促进COC1/DDP细胞的凋亡，凋亡率增加至14.45%(P＝0.002)。在不同浓度的DDP联合作用条件下，FCCP均表现为抑制细胞凋亡，增加COC1/DDP细胞对DDP的耐药性，而京尼平则表现为促进细胞凋亡，增加COC1/DDP细胞对DDP的敏感性，见图1。

图1 FCCP和京尼平对COC1/DDP细胞凋亡率的影响

2.2 FCCP和京尼平对COC1/DDP细胞ROS总产量的影响在没有DDP的情况下，FCCP使COC1/DDP细胞内的ROS总产量增加20.23%(P＝0.034)，京尼平使COC1/DDP细胞内的ROS总产量增加8.37%，差异无显著统计学意义(P＝0.254)。当DDP浓度为1μg/mL时，FCCP使COC1/DDP细胞内的ROS总产量增加69.50%(P＝0.003)，京尼平使COC1/DDP细胞内的ROS总产量减少45.10%(P＝0.001)。在DDP浓度分别为0.4和2.0μg/mL时，FCCP均使COC1/DDP细胞内的ROS总产量增加，而京尼平则使ROS总产量下降(P＜0.05)，见图2。

图2 FCCP和京尼平对COC1/DDP细胞ROS总产量的影响

2.3 ROS水平与COC1/DDP细胞耐药性的关系无论在DDP组，还是DDP联合FCCP或京尼平组，COC1/DDP细胞的凋亡率均随着细胞内ROS的总产量的降低而升高，提示DDP通过降低ROS水平来诱导COC1/DDP细胞凋亡。DDP联合京尼平组的斜率较DDP组更大，提示京尼平在DDP作用基础上，进一步降低细胞内ROS的含量，增加COC1/DDP细胞对DDP的敏感性，见图3。

图3 ROS水平与COC1/DDP细胞凋亡率的关系

3 讨论

本研究发现FCCP通过增加COC1/DDP细胞内的ROS产量，抑制肿瘤细胞的凋亡，相反，京尼平则通过降低细胞内ROS水平，增加肿瘤细胞对DDP的敏感性。

FCCP是作用于线粒体内膜的质子载体，通过降低线粒体内膜两侧的质子势能差，减少电子传递链的电子传递和ATP合成，是一种解偶联剂[11]。其常被用于研究细胞、组织内线粒体的生物学功能，但是由于其质子载体的功能并不仅仅局限于线粒体内膜，它还可以引起细胞膜的完全去极化，因此它在线粒体生物能量学相关研究领域有其局限性[12]。研究表明[13]FCCP的解偶联效应与其浓度有剂量效应关系。包括神经末梢、胰腺β细胞、胚肾细胞在内的多种组织，在高浓度的FCCP环境下(＞1μm)，表现为线粒体完全解偶联，导致细胞内钙离子浓度的改变和细胞内ROS的增加。FCCP适度的线粒体解偶联效应通常在10～300 nm浓度下产生，线粒体适度地解偶联可以改变细胞的耗氧量及线粒体氧化还原状态，减少线粒体ROS的产生。

本研究中使用FCCP模拟UCP2，且FCCP的浓度为0.4μmol/L，以期其发挥适度解偶联的作用。结果显示，在不同浓度的DDP与0.4μmol/L的FCCP联合作用下，COC1/DDP细胞的凋亡率较单用DDP组明显降低(P＜0.05)，提示UCP2解偶联作用对COC1/DDP细胞有保护作用，可降低其对DDP的敏感性。

京尼平是UCP2特异性的抑制剂，可抑制UCP2介导的“质子漏”效应，增加线粒体内膜两侧的质子势能，具有促进ATP生成，增加线粒体内ROS产量的作用[14]。本研究中应用京尼平抑制UCP2的解偶联作用，结果显示:2 mg/L的京尼平与不同浓度的DDP联合作用，COC1/DDP细胞的凋亡率较单用DDP组明显升高(P＜0.05)，提示京尼平通过抑制UCP2功能增加了COC1/DDP对DDP的敏感性。在传统医学中，京尼平被用作消炎利胆药中的成分，但它可与生物组织中的赖氨酸、羟赖氨酸及精氨酸等残基发生交联反应，生成一种深蓝色的“栀子蓝”色素，若将其作为抗肿瘤药物大剂量地用于人体，是否产生相应的毒副作用仍需要进一步研究。尽管如此，京尼平的作用机制和对卵巢癌细胞产生的增敏效应为本研究提供了一个新型的治疗DDP耐药卵巢癌的模式，即在一线诱导化疗或者复发后化疗的同时，联合使用UCP2抑制剂，可能更大程度地杀灭耐药细胞，延长卵巢癌患者的临床缓解期，甚至延长患者的总体生存期。

与预期结果矛盾的是，正常情况下，FCCP通过线粒体解偶联，应该降低细胞内ROS产量，但本实验结果显示，FCCP显著增加了COC1/DDP内的总体ROS水平。同样有趣的是，京尼平也没有按照预期的那样增加细胞内ROS的产量，相反地，经京尼平联合DDP处理的COC1/DDP细胞内ROS产量较对照组明显降低。分析原因:①本实验使用的ROS探针为二氯荧光素二酯(DCFH－DA)，可以很容易地渗入细胞膜，进入细胞内，被细胞内的H2O2氧化成不再具有渗透性的绿色荧光物质。电子传递链中的“电子漏”使O2形成超氧阴离子O2－，可以被超氧化物歧化酶SOD转换成H2O2。因此，H2O2和是体内最早期的两类ROS[15]。研究发现[16]DCFH－DA展现的绿色荧光很均一地分布于细胞质中，说明DCFH－DA并非线粒体来源H2O2的特异性探针，适用于细胞内总ROS水平的检测。线粒体内的ROS产量仅仅是细胞内总ROS产量的一部分，细胞的其他部位，如内质网、过氧化物酶等，仍有产生ROS的功能，因此，实验中经DCFH－DA测定的结果并不能完全反应线粒体内ROS的真实水平。②研究发现[11]在心肌缺血再灌注中，适宜浓度的FCCP可以开放线粒体K＋ATP通道，其效应为轻度升高细胞内ROS水平，进而保护心肌细胞免受损伤。笔者在预实验中也发现FCCP对细胞内ROS的总产量有剂量效应关系。预实验中使用不同浓度的FCCP单独处理COC1/DDP细胞，48 h后测定细胞内ROS产量，发现当FCCP浓度为0.2μmol/L时，细胞内ROS水平较对照组明显降低(P＜0.05)，当FCCP浓度为0.4μmol/L时，ROS水平与对照组无明显差异(P＞0.05)，但当FCCP浓度为1.2μmol/L时，ROS水平显著升高(P＜0.05)。本研究中使用的0.4μmol/L FCCP与DDP联合使用，可能成为了线粒体K＋ATP通道的开放剂，致使细胞内总ROS水平升高。可以推测，尽管京尼平可以增加线粒体内ROS的产量，但它可能通过其他途径(如TNF－α)来减少总体ROS的产生。以上结果说明了FCCP和京尼平并非线粒体特异性的解偶联剂或解偶联抑制剂，它们均可通过线粒体或者UCP2以外的途径参与ROS生成的调节。

ROS对肿瘤细胞耐药性的影响具有双向性。研究发现[17]某些产ROS的物质，如姜黄素，联合5－Fu或奥沙利铂使用可以显著增加肿瘤细胞对5－Fu或奥沙利铂的敏感性，抑制结肠癌细胞的增殖，但也有研究者发现[18]某些肿瘤的耐药细胞株中的ROS含量明显高于不耐药细胞株。根据ROS不同的作用方式，可以相应选择抗氧化剂或氧化剂来调节肿瘤细胞内的ROS水平，进而改变肿瘤细胞的耐药性。

由于本研究仅使用外源性的解偶联剂和UCP2抑制剂来调节UCP2的解偶联作用，并不能完全模拟UCP2在细胞或体内的所有生理功能，因此仅能为UCP2与人卵巢癌细胞的耐药性间的关系提供一定的线索，更准确的结论应该通过调节UCP2基因的表达方能得出。如通过沉默或插入UCP2基因，使UCP2在人卵巢癌细胞内低表达或高表达，进一步研究肿瘤细胞对DDP的敏感性的改变情况。

UCP2抑制剂京尼平可为与DDP的协同作用，促进细胞凋亡，并通过降低细胞内总体ROS水平，增加COC1/DDP细胞对DDP的敏感性。解偶联剂FCCP拮抗DDP的细胞毒作用，通过增加细胞内总体ROS水平降低COC1/DDP细胞对DDP的敏感性。