陈萧月，张永强，饶 青，宋晶睿，李艳梅*

1.贵州大学医学院(贵州 贵阳 550025)

2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室(贵州 贵阳 550014)

2019年12月以来，武汉市部分医院陆续发现了多例有华南海鲜市场暴露史的不明原因肺炎病例，现已证明为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染性疾病，其大规模传播已成为全球性的主要流行病学事件，随即世界卫生组织(WTO)将其正式命名COVID－19[1]。由于我国采取的严格防控措施和治疗手段，病毒在我国的蔓延已经初步抑制，这其中中药在防治新冠肺炎中起到关键性作用。目前疫情在全球蔓延，并已感染了全球220个国家和地区，总感染人数超过157，825，944例[2]。由于没有有效的防控措施，WTO最终要求会员国扩大应急反应机制并寻找新的疫苗和有效药[3]。

赵军宁等[4]认为对于COVID－19的治疗主要通过抗病毒、抗炎及免疫调节等，其次增强对于靶器官的保护、解热、化痰等。甘草－杏仁出自于《金匮要略》中的茯苓杏仁甘草汤，甘草味甘，性平，主五脏六腑寒热邪气，具有清热解毒以及滋润肺部的作用，日常多用于治疗咳嗽、痰多；杏仁味甘，性温，主咳逆上气，使肺气下通。二者结合有行气利水、升散外邪。李安琪等[5]通过此药成功治愈炎症与发热患者。

本研究基于网络药理学，通过筛选甘草－杏仁活性成分、预测靶点蛋白及信号通路、构建“中药－活性成分－靶点”网络图，从而预测活性成分、靶点蛋白和疾病通路之间的潜在作用机制，为中药治疗COVID－19提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 甘草－杏仁有效化合物及作用靶点筛选通过运用中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查询单味药的有效活性成分[6]，以“甘草”“杏仁”为搜索关键词，收集全部活性成分，并对其进行数据整理。依据筛选原则口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18筛选出中药各自的活性成分及对应的靶点信息，将筛选出的有效成分靶点进行整理后输入到Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)转换为Gene Symbol并获得Swiss－Prot ID。

1.2 COVID－19疾病靶点的收集检索COVID－19的重要靶点，以“Novel coronavirus pneumonia”为关键词，通过GeneCards数据库(http://www/genecards.org)，根据筛选原则:筛选GeneCards数据库中疾病与靶点相关性得分＞0.18的基因，将得到的疾病靶点与药物靶点进行交集处理获得共同靶点。

1.3 甘草－杏仁治疗COVID－19关键蛋白互作网络图构建将获得的药物－疾病共同靶点导入到STRING数据库(http://string－db.org/)，限定物种为“homo sapiens”，设置最低相互作用阈值(中等置信度)0.4，其余参数保持默认设置。

1.4 构建PPI网络核心基因利用Cytoscape 3.7.2软件插件Bisogenet进行靶蛋白互作PPI网络图的构建，并利用CytoNCA插件进行网络拓扑分析，将第一次筛选条件将度中心性DC设置为大于62，第二次筛选条件设置为中间中心性BC＞200。

1.5 “药物－成分－疾病靶点”网络图的构建应用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物－成分－疾病靶点”网络关系图，网络中节点(note)代表甘草－杏仁活性成分及治疗靶点；网络中边(edge)代表“单味药－活性成分”以及“活性成分－治疗靶点”的对应连接线；图中节点连线的多少用度(degree)来表示。

1.6 关键靶点GO富集分析与KEGG通路分析将关键靶点基因输入到STRING数据库中，分别得到GO富集生物学过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组成(cellular component，CC)，以及KEGG Pathway信号通路富集分析图，通过绘制气泡图和词云图来研究交集靶点的富集功能，进而阐述甘草－杏仁药对治疗COVID－19富集的主要信号通路。

1.7 成分－靶点分子对接从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载SARS－CoV－2 3CL水解酶(PDB ID:6lu7)和血管紧张素转化酶II(ACE2)(PDB ID:1r42)的3D结构pdb格式文件，运用Pymol软件对蛋白进行加氢、去水以及去除配体的操作并重新保存为pdb格式。从ZINC数据库(http://zinc.docking.org)下载化合物的3D结构保存为mol2格式。利用Auto Dock软件将化合物以及靶蛋白转换为pdbqt格式文件，最后运行Vina进行分子对接。结合能＜0时说明配体小分子能够自发的与受体蛋白结合在一起，并且能量越低结合越稳定，发挥作用的可能性越大。

1.8 研究方案设计本研究的整个分析步骤如图1所示。COVID－19疾病靶点基因通过GeneCards数据库挖掘。用TCMSP数据库筛选甘草－杏仁药对的有效活性成分和对应的靶点信息，用STRING数据库对其GO功能富集和信号通路富集分析。运用Auto Dock软件将筛选到的主要有效成分与SARSCoV－2 3CL水解酶、ACE2进行分子对接，技术路线如图1。

图1 甘草－杏仁治疗COVID－19机制分析技术路线图

2 结果

2.1 甘草－杏仁有效化合物和作用靶点的筛选通过TCMSP数据库检索到甘草－杏仁共393个化合物，其中甘草280个，杏仁113个，根据药物成分活性原则筛选OB≥30%、DL≥0.18，进一步筛选甘草－杏仁中甘草92个、杏仁19个有效活性成分，对应的靶点共1389个，将靶点信息输入到Uniprot数据库进行基因名和Swiss－Prot ID标准化。

2.2 疾病靶点收集设定筛选条件从GeneCards数据库中筛选出疾病相关靶点259个，根据筛选原则疾病与靶点相关性得分＞0.08。为了方便后续统计分析，将所获靶点转化为Uniprot数据库统一识别码格式。

2.3 甘草－杏仁潜在活性成分治疗COVID－19的作用靶点预测将药物有效成分靶点信息输入到Uniprot数据库进行基因名和Swiss－Prot ID标准化，得到Gene symbol形式。将化合物靶点与药物靶点进行映射得到46个共同基因作为甘草－杏仁治疗COVID－19的靶基因，见表1。

表1 甘草－杏仁治疗新冠病毒肺炎COVID－19的潜在靶点蛋白信息表

续表1

2.4 靶点蛋白PPI相互作用关系将获得的46个交集靶点蛋白导入STRING数据库中，构建蛋白互作网络关系图，设置置信度为0.4和“Human Sapiens”为筛选种属。得到的PPI网络图包含46个蛋白节点，620条蛋白相互作用连接线，平均节点度值为27，平均局部聚类系数为0.818，在线绘制网络图(图2)。

图2 甘草－杏仁靶点蛋白－蛋白相互作用网络图

2.5 网络拓扑分析结果根据“药物－疾病”靶点的网络药理学文本形成初步PPI网络，共有154 264个节点，第一次根据DC＞62筛选后得到1 488个节点，第二次根据BC＞200筛选后得到217个节点的网络图(图3)。

图3 PPI网络拓扑分析

2.6 构建可视化网络图采用Cytoscape 3.7.2软件构建“甘草杏仁－有效成分－疾病靶点”关系网络图，其中包含112个潜在有效成分和46个作用靶点，在可视化网络中得到药物靶向蛋白环氧化酶2(PTGS2，degree＝91)、丝裂原活化蛋白激酶－14(MAPK14，degree＝51)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2，degree＝67)，这3个蛋白可能为药对治疗COVID－19主要靶点(图4)。

图4 甘草－杏仁－有效化合物－作用靶点网络图

2.7 GO富集分析和KEGG通路分析结果将46个交集蛋白输入到STRING数据库进行生物富集分析得到GO生物学过程(biological processes，BP)1183条涉及生物调节、对刺激的反应、应激反应等(图5A)，GO分子功能(molecular function，MF)106条涉及酶结合、离子结合、有机化合物结合等(图5B)，细胞组成(cellular component，CC)57条涉及细胞外间隙、内膜系统等(图5C)，且对结果分析得到误差发生率(FDR)＜0.05。表明甘草－杏仁通过参与多种细胞过程从而发挥抑制COVID－19的作用，柱状图越长说明富集的基因越多。

图5 甘草－杏仁有效成分靶点GO富集功能分析图

进一步通过KEGG富集分析得到167条通路，按照靶点降数筛选20条靶点富集最多的通路，涉及IL－17信号通路、癌症通路、TNF信号通路等信号通路，绘制气泡图和词云图(图6)。

图6 甘草－杏仁有效作用靶点KEGG pathway气泡图与词云图

2.8 核心成分与ACE2和SARS－CoV－2 3CL水解酶分子对接结果分析通过药物－疾病靶点筛选结果发现，甘草－杏仁中主要有效成分有槲皮素、山奈酚和柚皮素等。为了进一步证明药物有效成分对COVID－19的潜在治疗作用，将3个主要有效成分分别与ACE2蛋白和SARS－CoV－2 3CL水解酶进行分子对接。一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生作用的可能性就越大。对接结果如图7，其中槲皮素通过HIS493、TKP207，山奈酚通过PRO490、THR26和GLY143，柚皮素通过TRP610，分别与ACE2蛋白SARS－CoV－2 3CL水解酶形成稳定氢键。由此表明槲皮素、山奈酚、柚皮素与靶蛋白具有较好的结合活性(图7)。

图7 分子对接结果

3 讨论

本研究通过运用网络药理学的方法，筛选出甘草－杏仁中潜在的有效成分获取其靶点，映射到治疗COVID－19的靶点，建立“药物－有效成分－靶点”可视化网络图，通过进一步筛选得到88个潜在活性成分和46个靶点蛋白，从系统层面揭示甘草－杏仁药对治疗COVID－19疾病的药理学机制。

通过对“药物－有效成分－靶点”可视化网络图的遴选得到主要有效成分包括:槲皮素(MOL000098)、山奈酚(MOL000422)、柚皮素(MOL004328)等。已有研究表明槲皮素通过抑制IL－6、MCP－1、IP－10、TNF－α、VEGF等炎症因子的产生从而发挥抗炎作用[7]。Si等[8]观察到槲皮素和碳六烯酸联用可以抑制一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)和环氧化酶－2(COX－2)的表达水平，减少脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞的炎症介质水平，从而发挥一定抗炎作用。山奈酚为黄酮类化合物，具有调节内质网应激及自噬作用并对功能失调的细胞具有保护作用，通过调节非癌性细胞的自噬来保护细胞免疫功能障碍[9－10]。柚皮素可以作用于巨噬细胞激活抗炎反应因子Nrf2导致血红霉素－1(H0－1)的表达[11]。本研究结果显示PTGS2、MAPK14、NOS2、PPARG、INF、IL2、CCL2、IL－10、CXCL8、STAT1、CASP8等自由度最高，可视为甘草－杏仁药对治疗COVID－19的主要靶点。其中IL2、CXCL8、CCL2、IL10、INF等为重要的炎症因子[12]。丝裂原活化蛋白激酶－14(MAPK－14)是丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)的重要成员之一，可通过促进SIRT1、FOXO、p53等活性因子抑制NF－κB活性从而减少炎性因子白介素的累积，减弱体内的炎症反应[13]。PTGS2在影响RNA病毒复制等方面发挥着重要作用[14]。NOS2利用NO的氧化应激协助巨噬细胞对抗病原体[15]。

GO生物功能富集分析及KEGG信号通路分析结果显示，甘草－杏仁在治疗COVID－19过程中主要涉及到癌症通路、AGE－RAGE信号通路、IL－17信号通路、TNF信号通路等，均与炎症发生过程密切相关。分子对接结果显示，甘草－杏仁中主要有效成分槲皮素、山奈酚、柚皮素与靶蛋白ACE2、SARSCoV2－3CL水解酶具有稳定的结合构象。

综上所述，甘草－杏仁治疗COVID－19的作用机制可能通过抑制炎症反应、调节细胞应激及功能障碍等过程起到潜在的治疗目的。由于网络药理学本身具有一定的局限性，甘草－杏仁的活性成分是否通过PTGS2、MAPK14、NOS2等作用于癌症通路、AGE－RAGE信号通路、IL－17信号通路和TNF通路而起到抑制COVID－19的作用仍需要进一步证明。