郭建仪，吕 静，马铭悦，张春辉，庄晓岩，张忠胜

1.辽宁中医药大学(辽宁 沈阳 110847)

2.辽宁中医药大学附属医院(辽宁 沈阳 110032)

慢性肾脏疾病在发展中国家非常普遍，对国家和社会造成很大负担[1]。慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)指疾病迁延发展所致的慢性肾脏病，会有肾脏纤维化和萎缩的表现，最终水、电解质、酸碱平衡紊乱，周身脏器受损，危及患者生命[2]。

郭恩绵教授认为CRF发病机制是湿浊毒邪内蕴，损伤肺脾肾三脏，之后侵及心肝，导致五脏虚损，气血阴阳不足，元气虚衰，因此命名为“虚劳水气病”[3]。以“肾虚毒蕴”的病机理论，提出补脾益肾，祛湿化浊，活血散瘀利水的治法，并归纳出角药、药对，分期而治[4]。本文所论“藿香－佩兰－大黄”是郭老治疗CRF常用角药，临床效果显著。“角药”是三味中药协同应用，源于《黄帝内经》“一君二臣，奇之制也”的理论，始见于《伤寒杂病论》[5]。通过分析中药特性，将三味中药合理地配伍，功效变化无穷，如三足鼎立，互为犄角[6]。

“藿香－佩兰－大黄”作为郭恩绵教授治疗CRF常用角药，可有效改善CRF的症状，临床应用非常广泛，但缺少细胞和分子水平阐述。网络药理学是一门综合学科，能够揭示各类药物对机体的调控原理[7]。本文运用网络药理学方法，探析“藿香－佩兰－大黄”角药治疗CRF的核心成分、核心靶点、关键通路及其作用机制，为后续实验研究提供依据与思路。

1 资料与方法

1.1 收集筛选“藿香－佩兰－大黄”活性成分及其作用靶点通过中医药系统药理学平台(TCMSP)寻找三味中药化学组成成分，本文所论藿香为广藿香。以口服利用度≥30%且类药性≥0.18对药物活性成分进行ADME属性筛选以获得活性化合物。筛选出的活性成分，进一步在TCMSP平台筛选其相关作用靶点。查询Uniprot数据库，明确各靶点蛋白相对应的基因名称。

1.2 收集筛选CRF靶点基因以“chronic renal failure”“慢性肾衰竭”为关键词，分别在Genecards数据库、Drugbank数据库、TTD数据库收集与CRF有关的靶点基因。Genecards数据库有Relevance score值表示靶点与疾病关联程度。Genecards数据库得到疾病靶点过多，筛选Relevance score＞中位数的疾病靶点纳入分析，若还是过多，再次用此法筛选，最后将3个数据库的靶点基因合并去重。

1.3 获取药物与疾病的共同靶点将得到的“藿香－佩兰－大黄”活性成分靶点基因和CRF靶点基因输入Venny平台，得到交集靶点，构建韦恩图。

1.4 构建蛋白质相互作用(PPI)网络将1.3获取其交集靶点基因提交STRING 11.0数据库，构建初步蛋白质相互作用模型，下载tsv文件，利用Cytoscape对PPI网络进一步分析构图，得到高级PPI网络，再通过Metascape平台得到潜在蛋白质功能模块。

1.5 GO功能、KEGG通路富集分析将交集靶点提交Metascape平台，进行GO和KEGG富集分析。GO包括生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组成(CC)。各筛选前20个结果，用Bioinformatics作气泡图。

1.6 构建“药物活性成分－疾病靶点－通路”网络筛选与93个交集靶点有关系的活性成分，藿香－佩兰－大黄初步纳入的19个活性成分中排除表1中的DH4。录入角药活性成分、交集靶点、20条KEGG富集通路，在cytoscape 3.7.1中，绘制“药物活性成分－靶点－通路”网络图。

1.7 分子对接验证在Pubchem数据库检索核心成分结构，保存mol格式。利用PDB蛋白质结构数据库，查询并下载核心靶点蛋白的3D结构，保存PDB格式。使用PyMol软件去掉蛋白结构的水分子和小分子配体，然后导入AutoDockTools进行加氢处理，将有效成分和核心蛋白均转成pdbqt格式文件。运行AutoDockTools对核心成分和核心靶点分别进行对接，记录最低结合能数值。

2 结果

2.1 药物活性成分及靶点筛选在TCMSP初步收集藿香化学成分94种，佩兰化学成分60种，大黄化学成分92种，ADME筛选之后得到藿香化学成分11种，佩兰化学成分7种，大黄化学成分10种。再次经过对相关文献及数据库的查询，最终纳入化学成分藿香8种，佩兰7种，大黄7种，藿香成分靶点165个，见表1。佩兰成分靶点84个，大黄成分靶点64个，去掉3者重复值，角药成分靶点共204个。

表1 “藿香－佩兰－大黄”角药活性成分

2.2 药物与疾病交集靶点的获取Genecards数据库收集疾病靶点基因8 258个，数目过多，将score从大到小排列，取中位数，按照Relevance score＞中位数加以筛选，反复3次，获得CRF靶点基因1035个，合并Drugbank、TTD数据库去重，共获1 064个靶点基因。利用Venny平台，获取成分和疾病交集靶点，有93个，见图1。

图1 药物－疾病靶点韦恩图

2.3 药物治疗CRF的PPI网络的构建角药与CRF交集靶点共93个，在STRING平台得到初级PPI网络(图2)。下载tsv数据，导入Cytoscape 3.7.1，构建更加清晰的高级PPI网络(图3)。此PPI网络由93个节点和1801条连线构成，节点面积越大，颜色越深，则越重要。Degree值排名前7的节点为AKT1、IL6、TNF、VEGFA、TP53、CASP3、MAPK1，分别是81、75、75、75、73、72、70，这些靶点可能是药物治疗CRF的关键靶点。

图2 初级PPI图

图3 高级PPI图

通过Metascape平台分子复合物检测算法(MCODE)识别其内在module，见图4。根据Log10(P)值，各保留3个最佳生物学进程，见表2。

表2 PPI网络module功能描述

图4 PPI网络的module

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析Metascape作GO功能分析，其中CC427个，MF611个，BP5292个；KEGG富集412条通路。分别取前20个，在Bioinformatics平台绘制GO、KEGG气泡图，见图5。图左侧为富集名称，气泡颜色由红到绿代表P值由大到小，气泡越大代表该通路的基因计数越多，横轴代表输入基因占该通路基因的比率。

图5 GO、KEGG气泡图

GO富集分析结果:BP主要集中在对无机物的反应、凋亡信号通路、细胞迁移的正向调控等；CC主要膜筏、囊泡腔、细胞质核周区域等；MF主要在激酶结合、细胞因子受体结合、蛋白域特异性结合。

KEGG富集分析结果显示:PI3K－Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGE－RAGE信号通路、乙型肝炎、癌症途径等。

2.5 “药物活性成分－疾病靶点－通路”网络图将“藿香－佩兰－大黄”药物活性成分、交集靶点基因、20条KEGG富集通路，上传到Cytoscape，绘制网络图，见图6。其中方形表示关键靶点基因，V形表示通路，圆形表示活性成分。网络图反映出角药治疗CRF有“多成分、多靶点、多通路”的机制。

图6 药物－疾病靶点－通路网络图

通过Cytoscape内置的NetworkAnalyzer插件分析角药治疗CRF的网络拓扑学参数，获取核心成分及靶点。槲皮素、木犀草素为核心成分，Degree值分别为76、35。尼泊尔鸢尾异黄酮、β－谷甾醇、豆甾醇、芦荟大黄素为重要成分，Degree值分别为15、13、8、8。PTGS2、RELA、TNF为核心靶点，Degree值为28、17、17。MAPK1、JUN、AKT1、RXRA、IL6为重要靶点，Degree值分别为16、16、16、15、15。

2.6 分子对接根据2.5中获得的核心成分及核心靶点，选择核心成分槲皮素、木犀草素与前3名靶点蛋白进行分子对接，验证作用机制。两者结合自由能越小，表明亲和力越大，越稳定，见表3。

表3 核心成分与靶点蛋白最低结合能

将核心成分与各靶点蛋白结合的化合物，可视化处理，见图7、图8、图9。以上分子对接结合能数值＜－7.0，说明核心成分和靶点蛋白结合很稳定，验证了研究结果的准确性。

图7 槲皮素、木犀草素与PTGS2的分子对接

图8 槲皮素、木犀草素与RELA的分子对接

图9 槲皮素、木犀草素与TNF的分子对接

3 讨论

中医并无CRF的直接记载，目前都是依据临床表现，将其归于“癃闭”“关格”“腰痛”“虚劳”等范畴[8]。CRF是肾脏疾病发展的最终结局，表现为五脏皆虚，气血阴阳不足，其中元气虚衰为核心。水气病，首见于《金匮要略·水气病脉证并治》，多指水液代谢类的疾患，以水肿为主要表现[9]。郭老认为CRF源于水气病，又有虚劳之本质，独创将其命名为“虚劳水气病”[3]。认为关键病机是肾虚毒蕴，治疗上以甘温扶阳、补益脾肾为本，再针对浊毒、瘀毒、水毒、湿毒的不同来用药，泄浊解毒是基本治法。临床常用藿香、佩兰配伍大黄芳香化浊、通腑泄毒。藿香振奋脾胃之气，佩兰重在行气，大黄入血分可泄血中之热，化血中之瘀毒；入气分则燥湿攻积，泻火解毒，如此“溺毒”可从血中解，从胃肠中除。三药协作，祛中焦湿气，振脾胃阳气，使邪有所出，体现“魄门亦为五脏使”的理论[10]。

“藿香－佩兰－大黄”角药治疗CRF有效成分中核心成分是槲皮素、木犀草素，核心靶点是PTGS2、RELA、TNF。有研究发现槲皮素可能通过调节氧化应激和iNOs/p38MAPK通路对腺嘌呤诱导的CRF衰竭大鼠有缓解作用[11]，还可降低CRF大鼠肾组织及血清EPO值，改善其铁代谢紊乱[12－13]；抑制CRF大鼠肾间质炎性细胞浸润[14]；防治泌尿功能衰竭[15]。木犀草素目前没有直接对CRF的相关研究，但是CRF与糖尿病肾病有一定联系。木犀草素有抗氧化作用，研究显示[16－17]通过降低肾组织内PAI－1、TGF－β1等表达；上调Nrf2激活抗氧化酶HO－1、SOD、γ－GCS的表达，保护STZ引发的糖尿病大鼠的肾脏功能。尼泊尔鸢尾异黄酮、β－谷甾醇、豆甾醇、芦荟大黄素等重要成分都有抗氧化、抗炎作用。PTGS2又叫做环氧化酶2(cyclooxygenase－2，COX－2)，在血管、肾小球、肾小管等表达。有研究显示[18]COX－2在肾血流动力学和电解质稳态中起着至关重要的作用，与肾小球硬化以及肾功能恶化有关。抑制COX－2的过度表达是预防和治疗CRF的有效途径之一[19]。

富集分析显示PI3K－AKT通路、IL－17通路、AGE－RAGE通路、NF－κB通路等。IL－17信号通路在急慢性炎症中发挥着重要作用，有效靶点TNF、PTGS2富集在IL－17信号通路上。有研究显示[20－21]螺内酯和有氧运动都可抑制AGE－RAGE信号通路，减少细胞内氧化应激。RELA是NF－κB家族重要成员，通过乙酰化、甲基化等形式来调节细胞增殖、分化和凋亡相关基因表达，涉及肿瘤、炎症、免疫反应等众多生理和病理活动[22]，可调控NF－κB通路抑制细胞凋亡和炎症反应[23]。AKT位于PI3K－AKT通路上，激活后介导多种生物学效应。CRF主要病理改变便是肾脏纤维化，多个研究[24－26]表明土茯苓、抗纤灵水煎剂可以通过抑制PI3K－AKT通路来抑制肾间质纤维化。分子对接结果显示两个核心成分槲皮素、木犀草素与PTGS2、RELA、TNF亲和力很好，结构稳定。

综上所述，通过网络药理学分析，“藿香－佩兰－大黄”角药治疗CRF通过槲皮素、木犀草素等多个成分，作用于PTGS2、RELA等多个靶点，调控PI3K－AKT通路、IL－17通路等多个信号通路，调节免疫及炎症反应、减少氧化应激、改善细胞异常增殖及凋亡，延缓肾纤维化进程，起到保护肾脏作用。对于临床用药提供了理论支持，后期会进一步实验验证。